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1.1 主要試劑

MRS培養(yǎng)基( M8330) 、甘油( G8190) ，北京某公司生產(chǎn); 細菌DNA 提取試劑盒( D3350-01) ，美國某公司生產(chǎn); 葡萄糖、麥芽糖等常規(guī)生化試劑，均購自陜西某公司。

1.2 主要儀器

pH 計( 型號為FE20) ; 分光光度計( 型號為LAMBDA-25) ; 高效液相色譜儀( 型號為1260) ; 生化培養(yǎng)箱( 型號為SNP-250) ; 超凈工作臺( 型號為SW-CG-1FD) 。

1.3 乳酸菌的分離

選擇健康成年散養(yǎng)雞，頸部放血致死，立刻無菌采集回腸和盲腸內(nèi)容物。稱量10 g 腸道內(nèi)容物，加入90 mL 無菌磷酸鹽緩沖液( PBS) ，渦旋振蕩5 min，按照10 倍梯度稀釋逐級稀釋( 1×10^-2 ～ 1×10^-6 ) ，然后各取100 μL 均勻涂布于MRS平板中，常氧條件下37 ℃倒置培養(yǎng)48 h。挑取無明顯菌落黏連、融鈣圈明顯、菌落形態(tài)和顏色不同的單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，劃線純化2 次。純化菌株與30%滅菌甘油按1 ∶1混合后-80 ℃保存，備用。

1.4 乳酸菌的鑒定

備選菌株37 ℃培養(yǎng)18 h，離心收集菌體后利用OMEGA 細菌DNA 提取試劑盒提取菌體DNA。以菌體DNA 為模板，以16S rＲNA 通用引物27F ( 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3') 和1 492Ｒ ( 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') 進行16s rＲNA 片段的擴增，擴增產(chǎn)物測序，測序結(jié)果通過NCBI 在線進行BLAST 比對，確定菌株的種屬。

1.5 產(chǎn)酸能力測定

備選菌株37 ℃培養(yǎng)48 h，將100 μL 培養(yǎng)液加入10 mL 改進的MRS 培養(yǎng)液中( 不加乙酸鈉和葡萄糖，但加入35 g /L 麥芽糖、5 g /L 果糖和0.01 g /L 溴酚藍) ， 37 ℃培養(yǎng)，連續(xù)觀察4 d，以溴酚藍作為酸堿指示劑記錄培養(yǎng)液顏色變化時的培養(yǎng)時間。在培養(yǎng)90 h以后利用pH 計測定培養(yǎng)液pH 值。為了進一步測定最大產(chǎn)酸量，將100 μL 培養(yǎng)液加入10 mL 改進的MRS培養(yǎng)液( 加入2%的CaCO₃) 中37 ℃ 培養(yǎng)48 h，利用高效液相色譜測定培養(yǎng)液中的乳酸和乙酸含量。

1.6 抑菌試驗

參照李龍等方法進行。將備選菌株按照1%接種于5 mL 的MRS液體培養(yǎng)基中， 37 ℃培養(yǎng)24 h，4 ℃保存，備用。配制固體LB 培養(yǎng)基( 蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂15 g，加入純化水定容至1 000 mL) ，每個平板倒入20 mL LB 固體培養(yǎng)基，冷卻，加入過夜培養(yǎng)的病原菌( 大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和巴氏桿菌) 培養(yǎng)液100 μL，均勻涂布于平板表面，平板干燥后等距離放入4 個牛津杯，每個牛津杯中加入200 μL 待測菌液，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，利用游標卡尺測定抑菌圈直徑( mm) 。每個菌株測定3 個重復，以不接種菌液的MRS液體培養(yǎng)基作為陰性對照。

1.7 表面疏水性和耐酸、耐膽鹽性

菌株表面疏水性參照D． Bujnakova 等的方法進行。菌株耐酸、耐膽鹽性參照N． Azami 等的方法進行。利用96 孔微孔板，分別加入200 μL MRS液體培養(yǎng)基( pH 值= 6.3) ，200 μL pH 值為2.5 的MRS液體培養(yǎng)基， 200 μL MRS液體培養(yǎng)基和200 μL含2%牛膽汁的MRS液體培養(yǎng)基( pH 值= 6.3) ，每孔加入1×10⁶cfu 的待測菌株，每個菌株重復3 次，培養(yǎng)24 h 后通過平板計數(shù)和在600 nm 處測定吸光度檢測活菌數(shù)量和菌株生長情況。

1.8 發(fā)酵飼料制備和細菌計數(shù)

參照NＲC( 1997) 飼養(yǎng)標準配制肉雞飼養(yǎng)前期( 0～21 d) 飼料配方，基礎(chǔ)日糧中無抗生素添加( 試驗基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1) 。以備選菌株作為發(fā)酵菌種，發(fā)酵菌株的添加量為1×10⁷cfu /kg，料水比為1 ∶1.5，密閉于飼料發(fā)酵袋中， 37 ℃培養(yǎng)72 h，每個菌株做3 個重復。分別在0，8，24， 48， 72 小時取樣測定發(fā)酵飼料pH 值、乳酸菌數(shù)量和乙酸、乳酸含量。發(fā)酵飼料pH 值測定參照劉曉明的方法進行，乳酸菌計數(shù)采用MRS平板計數(shù)法，乳酸和乙酸含量利用高效液相色譜法進行測定。

1.9 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析

采用SPSS 17.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用One-Way ANOVA 進行方差分析，LSD 法進行多重比較，試驗結(jié)果以“平均值±標準差”表示。

2.1 乳酸菌的分離與鑒定

通過形態(tài)和分子生物學鑒定，試驗共從肉雞胃腸道中分離得到98 株乳酸菌菌株，依次編號為FJ-1 至FJ- 98，其中唾液乳桿菌( Lactobacillus salivarius )19 株，羅伊乳桿菌( Lactobacillus reuteri) 17 株，約氏乳桿菌( Lactobacillus johnsonii) 14 株，植物乳桿菌( Lactobacillusplantarum) 9 株，干酪乳桿菌( Lactobacillusreuteri) 7 株，糞腸球菌( Enterococcus faecium) 20 株，屎腸球菌( Enterococcus faecium) 12 株。

2.2 產(chǎn)酸能力測定

通過對98株分離乳酸菌菌株產(chǎn)酸能力測定發(fā)現(xiàn)，不同的菌株產(chǎn)酸能力差異很大，指示劑變色時間范圍從17h(FJ-66)到88h(FJ-33)，乳酸的產(chǎn)量范圍從18mmol/L(FJ-22)到269mmol/L(FJ-38)，依據(jù)各菌株的產(chǎn)酸速度和乳酸濃度的高低，最終選出8株產(chǎn)酸特性好的乳酸菌菌株進行后續(xù)試驗。8株乳酸菌菌株產(chǎn)酸特性測定結(jié)果見表2。

由表5可知:在發(fā)酵前飼料的pH值為6.2，37℃發(fā)酵24小時菌株發(fā)酵組的pH值均降低，其中FJ-38和FJ-92較低，并且顯著低于對照組(P＜0.05);發(fā)酵72小時所有菌株發(fā)酵組pH值均顯著低于對照組(P＜0.05)，其中FJ-38和FJ-92較低。

發(fā)酵24小時所有菌株發(fā)酵組乳酸產(chǎn)量均顯著高于對照組(P＜0.05)，72小時乙酸含量顯著低于對照組(P＜0.05)，但在發(fā)酵72小時FJ-38和FJ-92菌株處理組乳酸產(chǎn)量較高，顯著高于其他處理組(P＜0.05)，所有菌株發(fā)酵組乳酸產(chǎn)量均顯著高于對照組(P＜0.05);FJ-67菌株雖然在之前的產(chǎn)酸性能測定上表現(xiàn)出了較強的產(chǎn)乳酸能力，但在飼料發(fā)酵試驗中其產(chǎn)酸能力低于其他菌株發(fā)酵組;在發(fā)酵24小時和72小時，所有菌株發(fā)酵組乳酸菌數(shù)量均顯著高于對照組(P＜0.05)，其中FJ-38和FJ-92在發(fā)酵72小時乳酸菌數(shù)量均超過1x10⁹cfu/mL。

發(fā)酵飼料是在飼料中接種不同的菌種在適當?shù)臏囟认伦匀话l(fā)酵而成的飼料，不同的接種物對發(fā)酵飼料的性質(zhì)有很大影響，本研究旨在篩選適合家禽發(fā)酵飼料的接種菌株。由于高的乳酸濃度和低的pH值是發(fā)酵飼料發(fā)揮抑菌特性的重要原因，因此本試驗首先對分離到的乳酸菌菌株進行了產(chǎn)酸能力分析，然后才進行了抑菌試驗和耐酸、耐膽鹽試驗。在本試驗中利用5株篩選到的菌株進行飼料發(fā)酵試驗，但所有乳酸菌發(fā)酵飼料乳酸含量均未能達到150mmol/L。但有研究結(jié)果表明，為有效降低病原菌濃度(大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌)，發(fā)酵飼料中乳酸的濃度必須大于100mmol/L，本試驗中有4株乳酸菌達到此要求，其中FJ-38和FJ-92菌株最接近乳酸濃度150mmol/L的要求。但在發(fā)酵試驗中，不同的飼料組成或料水比可能都會影響到最終發(fā)酵飼料的乳酸濃度，因此100mmol/L乳酸濃度作為評判發(fā)酵飼料優(yōu)劣可能更優(yōu)于150mmol/L。乙醇的產(chǎn)生會引起發(fā)酵飼料異味或干物質(zhì)的損失，但本試驗考慮到家禽味覺系統(tǒng)不發(fā)達，因此未對該指標進行測定分析。

雖然本試驗分離到的部分菌株產(chǎn)酸能力很強，但其是否能在家禽消化道發(fā)揮一定的益生特性有待研究。益生菌菌株應(yīng)具備良好的酸和膽鹽耐受力，并對腸上皮細胞具有良好的黏附特性。因此，本試驗還測定了候選菌株的耐酸(pH值=2.5)、耐膽鹽(2%牛膽汁)和表面疏水性，表面疏水性與益生菌黏附腸上皮細胞能力呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有5株菌株(FJ-38、FJ-54、FJ-67、FJ-85和FJ-92)表現(xiàn)出了良好的益生特性。結(jié)合飼料發(fā)酵的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)J-38和FJ-92無論從發(fā)酵效果和益生特性上在所有候選菌株中表現(xiàn)效果均最好。

雖然本試驗發(fā)現(xiàn)2株可能作為肉雞發(fā)酵飼料的候選菌株，但其在使用前還需要進一步深入研究。首先要進行耐藥性檢測，因為目前研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌同樣能通過水平基因轉(zhuǎn)移引發(fā)耐藥基因的傳播，帶來潛在風險;其次，優(yōu)化料水比并進行大規(guī)模發(fā)酵試驗，進一步確定其在生產(chǎn)中的使用效果;最后，還要進一步驗證其在低溫環(huán)境下的發(fā)酵效果，因為很多養(yǎng)殖場缺乏必要的加熱設(shè)備，在自然環(huán)境溫度的作用下其發(fā)酵效果可能會出現(xiàn)差異。