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導(dǎo)讀

　　仔豬斷奶后，生長(zhǎng)發(fā)育快，但消化道發(fā)育不全，免疫力低，易造成厭食、下痢、生長(zhǎng)停滯、失重甚至死亡。乳酸菌飼料制劑具有維護(hù)動(dòng)物腸道健康、緩解不良應(yīng)激、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝和改善畜產(chǎn)品品質(zhì)的功能，是我國(guó)2008年批準(zhǔn)使用的飼料添加劑。但由于乳酸菌飼料制劑生產(chǎn)工藝不完善，尤其是干燥技術(shù)，乳酸菌制成粉末制劑后大量失活，應(yīng)用效果不好，一直未得到大規(guī)模應(yīng)用。乳酸菌活菌制劑的干燥技術(shù)主要有冷凍干燥技術(shù)、噴霧干燥技術(shù)、真空干燥和流化床干燥技術(shù)。目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的乳酸菌菌粉是通過(guò)冷凍干燥制備而成，但是冷凍干燥存在生產(chǎn)不連續(xù)、成本較高、周期較長(zhǎng)、耗能大等問(wèn)題。相比于冷凍干燥，噴霧干燥具有可連續(xù)生產(chǎn)、成本較低、高效等特點(diǎn)；但由于噴霧干燥技術(shù)采用高溫氣化干燥，對(duì)不耐熱的菌株破壞較大。課題組前期通過(guò)紫外誘變和高溫馴化獲得一株耐消化、耐高溫的嗜酸乳桿菌菌株，將其發(fā)酵液通過(guò)噴霧干燥技術(shù)降低水分含量，并通過(guò)噴霧干燥工藝優(yōu)化提高其存活率，可在降低成本的前提下，保證其應(yīng)用效能。

　　因此，本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)篩選乳酸菌制劑的最優(yōu)包埋壁材；并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化噴霧干燥工藝；然后對(duì)乳酸菌制劑微膠囊的外觀結(jié)構(gòu)、包埋率和穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估；最后以斷奶仔豬實(shí)驗(yàn)考察乳酸菌制劑的應(yīng)用效果。

　　1材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 菌種

　　嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophillus)FZU-LA1301X，課題組前期篩選保存。

　　1.1.2 培養(yǎng)基

　　MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，牛肉膏10.0 g，葡萄糖20.0 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，吐溫80 0.1 mL，七水硫酸鎂0.58 g，四水硫酸錳0.025 g，蒸餾水1 000 mL。121℃滅菌20 min。

　　MRS固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.5％的瓊脂。

　　1.1.3 乳酸茵飼料制劑微膠囊壁材的選擇

　　1.1.3.1 微膠囊壁材及濃度的選擇

　　以阿拉伯膠、明膠、β-環(huán)糊精、麥芽糊精和可溶性淀粉5種不同材料作為壁材，分別配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％，15％和20％的溶液，使用均質(zhì)機(jī)在10 000 r/min速率下均質(zhì)3 min，形成穩(wěn)定、均勻且流動(dòng)性好的壁材溶液。通過(guò)測(cè)定噴霧干燥后菌粉中的活菌數(shù)，選擇較優(yōu)的壁材及濃度。

　　1.1.3.2 嗜酸乳桿菌微膠囊的制備

　　將壁材溶液在室溫下與等體積的嗜酸乳桿菌菌懸液(濃度約為4.50×108CFU/mL)}昆合，充分?jǐn)嚢杌旌虾笤谶M(jìn)口溫度160℃、進(jìn)料速率500 mL/h的條件下進(jìn)行噴霧干燥制備嗜酸乳桿菌微膠囊，然后根據(jù)各壁材在噴霧干燥過(guò)程中的性狀表現(xiàn)選取最佳壁材。

　　1.2 方法

　　1.2.1 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化噴霧干燥工藝

　　乳酸菌制劑噴霧干燥過(guò)程是先將乳酸菌菌懸液與壁材溶液混合形成均勻的料液，然后料液經(jīng)蠕動(dòng)泵進(jìn)入噴霧干燥霧化器形成細(xì)小的霧滴，再與高溫的熱空氣接觸，在極短的時(shí)間內(nèi)蒸發(fā)水分，經(jīng)過(guò)旋風(fēng)分離器，最后得到乳酸菌菌粉。由于噴霧干燥工藝條件如進(jìn)口溫度、進(jìn)料速率和壁材比例等，會(huì)對(duì)菌粉中的活菌數(shù)產(chǎn)生直接影響，所以通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)各工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)中選擇了L9(34)正交表。4個(gè)因素為A進(jìn)口溫度、B進(jìn)料速率、C壁材比例(阿拉伯膠：麥芽糊精)和D壁材濃度，詳見(jiàn)表1。

　　1.2.2 微膠囊包埋率和穩(wěn)定性測(cè)定

　　包埋率是指微膠囊中的活菌數(shù)與產(chǎn)品中的活菌數(shù)的比值。采用低溫高速離心機(jī)在4℃，1 000 r/min速率下離心20 min，離心沉淀微膠囊，未被包埋的菌體處于上清液中，然后通過(guò)涂布培養(yǎng)法，分別測(cè)定產(chǎn)品中的總活菌數(shù)和沉淀中的活菌數(shù)，來(lái)計(jì)算包埋率。

　　穩(wěn)定性是含活菌制劑微膠囊質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，為評(píng)價(jià)微膠囊的貨架穩(wěn)定性，將噴霧后的微膠囊分別置于室溫(25℃)和4℃條件下貯藏90 d，并定期測(cè)定其活菌數(shù)。

　　1.2.3 微膠囊產(chǎn)品的外觀測(cè)定

　　利用Phenom G2 pro飛納臺(tái)式掃描電子顯微鏡對(duì)微膠囊產(chǎn)品的外觀進(jìn)行表征。

　　1.2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

　　1.2.4.1 斷奶仔豬生長(zhǎng)性能測(cè)定

　　300只斷奶仔豬(3周齡)分成2組(每組150只)：一組對(duì)照組，喂食基礎(chǔ)日糧；一組乳酸菌組，在基礎(chǔ)Et糧中添加100 g/t噴霧干燥乳酸菌粉(活菌數(shù)為8.70 LogCFU/g)，試驗(yàn)期30 d。試驗(yàn)期間觀測(cè)試驗(yàn)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能，包括：平均日增重、平均日采食量、料重比、腹瀉率和死亡率。

　　1.2.4.2 斷奶仔豬糞便樣品微生物測(cè)定

　　試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組隨機(jī)采集新鮮糞便樣品，分別用MRS培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基通過(guò)涂布培養(yǎng)法測(cè)定其中的乳酸菌及大腸桿菌的活菌數(shù)。

　　2結(jié)果與討論

　　2.1 乳酸菌飼料制劑噴霧干燥壁材的選擇

　　2.1.1 微膠囊壁材的選擇

　　在微膠囊的制備中，壁材特性是影響微膠囊特性至關(guān)重要的因素，理想的壁材具有高度溶解性、無(wú)毒無(wú)害、優(yōu)良的乳化性質(zhì)、成膜性好、溶液黏度低及成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選取阿拉伯膠、麥芽糊精、可溶性淀粉、β-環(huán)糊精和明膠5種常用微生物微膠囊壁材進(jìn)行噴霧干燥制備乳酸菌飼料制劑。在噴霧干燥過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，明膠在常溫時(shí)易凝結(jié)成膠狀，無(wú)法形成流動(dòng)性好的體系，而β-環(huán)糊精在較高濃度時(shí)會(huì)呈現(xiàn)顆粒狀，較難形成均勻的體系，不利于之后的噴霧干燥，且在噴霧干燥過(guò)程中，微膠囊產(chǎn)品可能會(huì)在噴霧干燥塔的塔壁上停留而導(dǎo)致活菌數(shù)下降，所以本課題選擇黏度較低，分散均勻的阿拉伯膠、麥芽糊精、可溶性淀粉作為主要的壁材進(jìn)行研究。

　　2.1.2 壁材濃度及組合比例的優(yōu)化

　　2.1.2.1 壁材濃度的優(yōu)化

　　在確定阿拉伯膠、麥芽糊精和可溶性淀粉作為噴霧干燥的壁材后，在進(jìn)口溫度160℃，進(jìn)料速率500 mL/h條件下，以活菌數(shù)為指標(biāo)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)篩選壁材的最佳濃度，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，阿拉伯膠和可溶性淀粉在15％時(shí)具有較好的噴霧效果，麥芽糊精在15％、20％和25％時(shí)活菌數(shù)差異不大；且阿拉伯膠比麥芽糊精和可溶性淀粉具有較好的保護(hù)效果。

　　2.1.2.2 壁材組合及組合比例的優(yōu)化

　　將阿拉伯膠、麥芽糊精和可溶性淀粉按1：1的比例兩兩組合，配置濃度為15％的壁材溶液，與等體積的嗜酸乳桿菌菌懸液混合，在進(jìn)口溫度160℃、進(jìn)料速率500 mL/h的條件下進(jìn)行噴霧干燥，并以產(chǎn)品的活菌數(shù)為指標(biāo)，篩選最佳壁材組合，結(jié)果見(jiàn)圖2。阿拉伯膠/麥芽糊精組合的保護(hù)效果最好，產(chǎn)品的活菌數(shù)為8.54 LogCFU/g。

　　將阿拉伯膠、麥芽糊精按1：7、1：8、1：9和1：10的比例混合，配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％的壁材溶液，與等體積的嗜酸乳桿菌菌懸液混合，在進(jìn)口溫度160℃、進(jìn)料速率500 mL/h的條件下進(jìn)行噴霧干燥，并以產(chǎn)品的活菌數(shù)為指標(biāo)，篩選最佳壁材配比濃度，結(jié)果見(jiàn)圖3。可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)阿拉伯膠：麥芽糊精=1：7時(shí)噴霧效果最好，活菌數(shù)為8.62 LogCFU/g；但四種組合比例的活菌數(shù)差異并不顯著。

　　2.2 乳酸菌飼料制劑噴霧干燥條件的優(yōu)化

　　在噴霧干燥過(guò)程中，除了壁材種類(lèi)、濃度和組合比例會(huì)影響噴霧效果，噴霧干燥的工藝條件也是重要的影響因素。本實(shí)驗(yàn)以嗜酸乳桿菌活菌數(shù)為指標(biāo)，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)來(lái)確定最佳的進(jìn)口溫度、進(jìn)料速率、壁材組合比例和壁材濃度，結(jié)果見(jiàn)表2。

　　由表2可知，極差R的排列順序?yàn)椋哼M(jìn)口溫度、壁材濃度、進(jìn)料速率、壁材組合比例。經(jīng)分析。最佳噴霧條件為A1D2B1C3，即進(jìn)口溫度160℃、壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)20％，進(jìn)料速率400 mL/h和壁材比例1：9，對(duì)A1D2B1C3組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，噴霧后活菌數(shù)為8.70 LogCFU/g。

　　2.3 乳酸茵飼料制劑微膠囊品質(zhì)評(píng)估

　　2.3.1 微膠囊外部結(jié)構(gòu)

　　采用掃描電鏡對(duì)乳酸菌飼料制劑微膠囊產(chǎn)品進(jìn)行形態(tài)觀察，結(jié)果如圖4所示。微膠囊多為球形或橢圓球形，直徑約為5μm，表面可能由于干燥時(shí)高溫脫水導(dǎo)致凹凸不平。

　　2.3.2 微膠囊包埋率

　　微膠囊的包埋率是評(píng)價(jià)微膠囊質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，通過(guò)1.2.2中的方法計(jì)算噴霧干燥后微膠囊的包埋率。實(shí)驗(yàn)中得到的微膠囊平均包埋率為72.8％。

　　2.3.3 微膠囊穩(wěn)定性

　　將噴霧干燥制備的微膠囊分別置于常溫(約25℃)和4℃條件下貯藏，并定期測(cè)定其活菌數(shù)，結(jié)果如圖5所示。由圖可知，無(wú)論是在4。C還是常溫保存，嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)都呈下降趨勢(shì)。4℃貯藏時(shí)下降較緩，第45 d活菌數(shù)為7.0 LogCFU/g，第90 d時(shí)活菌數(shù)為6.23 Log CFU/g；而常溫下貯藏15 d活菌數(shù)大約下降一個(gè)數(shù)量級(jí)，第30 d時(shí)活菌數(shù)為6.08 LogCFU/g

　　2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)估乳酸菌飼料制劑的應(yīng)用效果

　　通過(guò)斷奶仔豬動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)估乳酸菌飼料制劑的應(yīng)用效果，結(jié)果見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)30 d喂食，實(shí)驗(yàn)組仔豬的日均增重顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；在腹瀉率和死亡率方面，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的腹瀉率和死亡率分別下降57.55％和40.03％，可見(jiàn)在飼料中添加乳酸菌可以促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)，防治仔豬腹瀉，降低斷奶仔豬的死亡率。

　　Davis等認(rèn)為在飼料中添加乳酸菌能改變動(dòng)物消化道的菌群組成。乳酸菌能夠通過(guò)產(chǎn)酸降低腸道的pH值，促進(jìn)蛋白酶等消化酶的分泌，有利于機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)。張乃鋒等發(fā)現(xiàn)在飼料中添加植物乳桿菌能顯著提高生長(zhǎng)豬的生長(zhǎng)性能；肖宏德等在斷奶仔豬的日糧中添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌復(fù)配而成的益生菌制劑代替抗生素，發(fā)現(xiàn)能達(dá)到與抗生素持平的促生長(zhǎng)效果。

　　乳酸菌與大腸桿菌的數(shù)量比值被認(rèn)為是評(píng)價(jià)動(dòng)物消化道微生物平衡的重要標(biāo)志，乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸能降低腸道pH值，抑制大腸桿菌等腸道病原菌的生長(zhǎng)。索成等給斷奶仔豬喂食添加了植物乳桿菌ZF316的日糧后，發(fā)現(xiàn)增加了仔豬消化道中的乳酸菌數(shù)量，且降低了大腸桿菌的數(shù)量，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。

　　乳酸菌制劑對(duì)斷奶仔豬糞便乳酸菌和大腸桿菌的影響如表4所示。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的仔豬糞便中乳酸菌數(shù)量顯著高于對(duì)照組，而大腸桿菌數(shù)量低于對(duì)照組。

　　3結(jié)論

　　本研究利用課題組前期開(kāi)發(fā)的耐消化、耐高溫的嗜酸乳桿菌菌株，通過(guò)噴霧干燥技術(shù)開(kāi)發(fā)低成本的高穩(wěn)定性乳酸菌飼料制劑，以期將其運(yùn)用于斷奶仔豬的飼養(yǎng)，以降低仔豬在斷奶后的腹瀉率和死亡率。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定了乳酸菌飼料制劑的最佳制備條件為：以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的阿拉伯膠和麥芽糊精按1：9的比例混合作為壁材，在進(jìn)口溫度160℃，進(jìn)料速率400 mL/h條件下進(jìn)行噴霧干燥。最終的微膠囊產(chǎn)品的嗜酸乳桿菌活菌數(shù)為8.69 LogCFU/g；顆粒直徑約5txm，包埋率為72.8％；在25℃室溫下貯藏30 d，嗜酸乳桿菌活菌數(shù)為6.08 LogCFU/g。通過(guò)斷奶仔豬動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)估產(chǎn)品的應(yīng)用效果發(fā)現(xiàn)，該產(chǎn)品能有效地促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)，降低仔豬的腹瀉率和死亡率；并且仔豬糞便中的乳酸菌與大腸桿菌的比值明顯高于對(duì)照組。

　　因此，整體而言，該乳酸菌飼料制劑具有較好的常溫穩(wěn)定性，且應(yīng)用效果突出，具有替代傳統(tǒng)酸化劑的潛力，市場(chǎng)前景廣闊。