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菌酶協(xié)同制備菜籽肽工藝的優(yōu)化及其營養(yǎng)成分分析

2021-05-19 15:32:27      點擊:

摘要:試驗旨在考察枯草芽孢桿菌B1與中性蛋白酶協(xié)同發(fā)酵和酶解處理(簡稱菌酶協(xié)同酵解)制備萊籽肽的最佳工藝條件及對經(jīng)菌酶酵解后的萊籽粕營養(yǎng)成分的分析。以萊籽肽得率為主要指標(biāo),通過對加酶量、發(fā)酵溫度和料水比等酶解、發(fā)酵條件的單因素和正交試驗,確定了萊籽肽以菌酶同時添加為最佳制備方式,以枯草芽孢桿菌接種量1.0%、中性蛋白酶添加量150U/g、料水比1:1.0、發(fā)酵溫度35℃、發(fā)酵時間48h為最佳菌酶協(xié)同酵解條件。在此條件下,菜籽粕中硫代葡萄糖苷(硫苷)的降解率達(dá)74.23%,單寧和植酸的降解率分別為31.17%和16.39%。發(fā)酵后萊籽粕中粗蛋白含量達(dá)41.30%,比發(fā)酵前提高1.92%,萊籽肽含量達(dá)170.12mg/g,比發(fā)酵前提高了3.7倍,還原糖含量比發(fā)酵前提高了57.68%,鈣、磷含量分別比發(fā)酵前提高了26.83%和11.57%。試驗表明,菌酶協(xié)同處理的方式對萊籽粕品質(zhì)的提升有較好作用。

我國是菜籽粕產(chǎn)量居世界第一的國家,每年產(chǎn)量可達(dá)近千萬噸。菜籽粕營養(yǎng)豐富,粗蛋白含量達(dá)35%~45%,同時含有較豐富的Ca、Mg、P、Se及多種營養(yǎng)物質(zhì),其中Se含量在植物性蛋白中含量最高。菜籽蛋白幾乎不存在限制性氨基酸,且其氨基酸組成接近聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦值,是優(yōu)良的天然植物蛋白資源。但由于菜籽粕中含有硫代葡萄糖苷(硫苷)、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì),降低了蛋白質(zhì)(氨基酸)的消化利用率,極大地限制了其在畜禽日糧中的應(yīng)用。

國內(nèi)外學(xué)者曾采用微生物發(fā)酵法對菜籽粕進(jìn)行脫毒,取得了顯著效果;同時研究還發(fā)現(xiàn),菜籽蛋白經(jīng)微生物降解后可得到低分子量的菜籽肽。菜籽肽具有低抗原性、酸溶性、低黏度等特點,且在體內(nèi)消化吸收快,能有效提高菜籽蛋白利用率。目前,單一依靠微生物發(fā)酵所得菜籽肽含量較少。因此,本研究在前期獲得優(yōu)良脫毒菌株及最佳脫毒工藝的基礎(chǔ)上,以菜籽蛋白降解為目標(biāo),嘗試在微生物發(fā)酵脫毒的基礎(chǔ)上添加中性蛋白酶,進(jìn)行菌酶協(xié)同酵解工藝研究,以期擴(kuò)大菜籽肽得率,為進(jìn)一步提高菜籽粕的利用率提供支持。

材料與方法

1 原料及菌種

菜籽粕購自紹興某飼料有限公司,粗蛋白含量≥32%,硫苷含量≥35μmol/g;中性蛋白酶購自Sigma公司,酶活500U/mg;枯草芽孢桿菌B1(Bacil-lus subtilis-B1)為本實驗室篩選獲得的高效硫苷降解菌,于-4℃保藏于斜面培養(yǎng)基。

2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、瓊脂2%,pH值7.0~7.2,H20 1000ml。   

液體培養(yǎng)基:不加瓊脂,其余成分與斜面培養(yǎng)基相同。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:菜籽粕100%、料水比1:1,pH值自然。

3 方法

3.1 菌種活化

無菌條件下接一環(huán)斜面菌種B1于液體培養(yǎng)基中,于37℃、200r/min培養(yǎng)20h,菌體濃度達(dá)108CFU/ml。

3.2 菜籽粕菌酶酵解的方法

稱取100g新鮮菜粕,加入100ml H20,按2%(菜籽粕干料重)的接種量、100U/g(菜籽粕干料重)的加酶量加入活化液體菌液、中性蛋白酶(具體接種和加酶的方式見表1),混合均勻,裝入500ml罐頭瓶中,用無菌報紙封口,置于30℃培養(yǎng)48h,分別在試驗設(shè)定時間取出,50℃烘干至恒重,粉碎過80目篩待測。

3.3 單因素試驗

設(shè)計4種不同的菌酶發(fā)酵菜粕方式(見表1)。以硫苷降解和肽含量為指標(biāo),在獲得的最佳發(fā)酵方式下,以肽含量為指標(biāo),分別進(jìn)行不同B1接種量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)、不同酶添加量(50、100、150、200、250U/g)和不同料水比(1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2)的單因素試驗。

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3.4 正交試驗

發(fā)酵工藝優(yōu)化采用3因素3水平L9(33)正交試驗,共設(shè)9個處理,每個處理3個重復(fù),各參數(shù)水平根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選擇接種量、酶添加量、料水比3個因素進(jìn)行正交試驗,隨后篩選出優(yōu)化組合。

3.5 檢測方法

硫苷含量檢測采用氯化鈀分光光度法;硫苷分解產(chǎn)物異硫氰酸酯(ITC)和噁唑烷硫酮(OZT)含量檢測參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 13087-91.GB 13089-91;單寧含量檢測參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15686-2008;植酸含量檢測采用分光光度法;粗蛋白含量檢測采用凱氏定氮法;菜籽肽含量檢測:稱取過80目篩的待測樣品,加入等體積10%三氯乙酸(TCA),在160r/min下振蕩30min,而后4000r/min離心15min,取上清液采用Folin一酚法測定蛋白質(zhì)總量;菜粕蛋白分布采用SDS—PAGE凝膠電泳;還原糖含量檢測采用DNS分光光度法;鈣含量檢測參照GB/T 13885—2003,磷含量檢測參照GB/T 6437—2002。

4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析,多重比較采用LSD法,顯著水平為P<0.05。

結(jié)果與分析

1 菌酶協(xié)同酵解菜粕方式的確定(見表2)

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由表2可知,處理方式3,即菌酶同步發(fā)酵,在菜籽肽含量提高和硫苷降解方面,同時取得較好的效果,硫苷降解率達(dá)到68.10%,菜籽肽含量為140.78mg/g,比發(fā)酵前提高了3.21倍。而處理4,即菌酶分步發(fā)酵方式,雖然菜籽肽含量的提高效果明顯,但硫苷降解效果較差。因此,選擇菌酶同步添加的方式進(jìn)行協(xié)同酵解后續(xù)的單因素試驗。

2 菌酶協(xié)同酵解條件研究

2.1 接種量對菜籽肽含量的影響(見圖1)

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隨著接種量的增加,菜籽肽含量呈現(xiàn)先增加、后下降的變化過程。當(dāng)接種量為1.5%時,菜籽肽含量達(dá)156.4mg/g,接種量為2%時,菜籽肽含量達(dá)164.3mg/g,增加幅度不大,因此本試驗選擇適宜接種量為1.5%。

2.2 酶添加量對菜籽肽含量的影響(見圖2)

圖2表明,當(dāng)中性蛋白酶添加量為100U/g時,菜籽肽含量達(dá)到161.2mg/g;當(dāng)酶添加量為250U/g時,菜籽肽含量最高,達(dá)166.4mg/g,與添加100U/g相比,增加幅度不大,考慮到加酶成本,本試驗確定酶的適宜添加量為100U/g。

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2. 3 料水比對菜籽肽含量的影響(見圖3)

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結(jié)果表明,隨著發(fā)酵體系中水分含量的增加,菜籽肽含量呈逐漸增加的趨勢,但考慮到含水率增加時,會顯著影響到硫苷的脫毒效果,而料水比在1:1、1:1.1和1:1.2時,對菜籽肽含量的影響不大,因此確定最適料水比為1:1。

2.4 菌酶協(xié)同酵解條件的正交試驗

以菜籽肽含量為指標(biāo),選取接種量、酶添加量和料水比進(jìn)行3因素3水平正交試驗試驗,因素水平編碼表和設(shè)計實施方案見表3。試驗結(jié)果及方差分析見表4和表5。


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正交試驗的結(jié)果顯示,接種量、酶添加量和料水比3個因素中,酶添加量和接種量是影響小肽含量的顯著因素。3個因素對小肽含量的影響,依次為酶添加量>接種量>料水比。根據(jù)正交試驗結(jié)果確定的最佳發(fā)酵條件為:接種量為1.0%,酶添加量為150U/g,料水比為1:1.0。

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3 菌酶協(xié)同酵解菜粕營養(yǎng)成分分析

根據(jù)正交試驗得到的最佳條件,進(jìn)行菌酶協(xié)同酵解菜籽粕,并對處理前后的菜籽粕進(jìn)行了營養(yǎng)成分分析和蛋白凝膠電泳,結(jié)果見表6和圖4。

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討論

菜籽粕中存在較多的抗?fàn)I養(yǎng)因子,其中硫苷是最主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子,其含量較高。物理法和化學(xué)法脫毒存在耗能高、蛋白損失大、成本昂貴等缺陷限制了其使用,微生物發(fā)酵法脫毒因其在很多方面能克服物理和化學(xué)法的缺點而受到普遍的重視和應(yīng)用。本試驗中,采用微生物發(fā)酵協(xié)同酶解處理后,菜籽粕中硫苷的降解率達(dá)74.23%,與黃茜等利用篩選獲得的枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌和釀酒酵母進(jìn)行菜粕發(fā)酵,得到硫苷的降解率達(dá)到89.06%的結(jié)果一致。同時,試驗還表明,通過發(fā)酵可提高菜籽粕中的粗蛋白含量。劉軍等從土壤中分離出若干霉菌、酵母菌和細(xì)菌,對其中3支菌株混合發(fā)酵,結(jié)果菜粕的粗蛋白含量提高了23%;國外Adarsh Palvigl利用少孢根霉發(fā)酵菜籽餅粕也發(fā)現(xiàn)蛋白含量得到增加。試驗證實了微生物發(fā)酵是改良菜籽粕的有效手段。

目前,對植物源蛋白及活性肽的研究日益成為食品、醫(yī)藥及飼料等領(lǐng)域的熱點。本試驗中小肽含量比發(fā)酵前提高了3.7倍,菜籽粕中還原糖、Ca、P含量分別比發(fā)酵前提高了57.68%、26.83%和11.57%。同時SDS—PAGE蛋白凝膠電泳結(jié)果也表明,菜粕經(jīng)菌酶協(xié)同酵解后,蛋白組分中高于25kD的大分子蛋白得到了較充分的降解。據(jù)報道,用蛋白酶酶解制備菜籽肽,可得到分子量較小的小肽,且蛋白水解度較高。但作為飼料添加劑生產(chǎn)成本太高,同時酶解法對植物源蛋白中抗?fàn)I養(yǎng)因子的去除效果并不理想。采用菌酶協(xié)同酵解法制備菜籽肽,枯草芽孢桿菌能分解其中的抗?fàn)I養(yǎng)因子作為營養(yǎng)物質(zhì)供自身的生長,從而達(dá)到脫毒的效果,同時外源蛋白酶與微生物發(fā)酵產(chǎn)生的酶,將大分子量的蛋白降解為小分子量的蛋白肽,可有效提高菜粕的品質(zhì)及蛋白利用率,為菜籽粕的深入開發(fā)提供新的途徑。

結(jié)論

本試驗對菌酶協(xié)同酵解生產(chǎn)高品質(zhì)菜粕的發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究,通過單因素及正交試驗,確定了采用枯草芽孢桿菌與中性蛋白酶同步發(fā)酵的方式,當(dāng)接種量為1.0%,酶添加量為150U/g,料水比為1:1.0,發(fā)酵溫度為35℃,發(fā)酵時問為48h時,菜籽粕中硫代葡萄糖苷(硫苷)的降解率達(dá)74.23%,其分解產(chǎn)物異硫氰酸酯(ITC)和嗯唑烷硫酮(OZT)的含量分別比發(fā)酵前降低了79.07%和55.56%;發(fā)酵后菜粕中單寧和植酸含量分別降低了31.17%和16.39%;發(fā)酵后菜籽粕中粗蛋白含量達(dá)41.30%,比發(fā)酵前提高1.92%,菜籽肽含量達(dá)170.12mg/g,比發(fā)酵前提高了3.7倍,還原糖含量比發(fā)酵前提高了57.68%,鈣、磷含量分別比發(fā)酵前提高了26.83%和11.57%。同時,SDS—PAGE電泳結(jié)果表明,菌酶協(xié)同酵解工藝處理后,菜籽蛋白中大分子量亞基均得到較好的降解效果。

實戰(zhàn)操作技術(shù)——棉菜籽餅脫毒變身優(yōu)質(zhì)飼料替代豆粕操作新技術(shù)

當(dāng)前豆粕價格很高有些地方貨源緊缺,而棉菜籽餅(棉籽粕、菜籽粕)價格相對便宜,棉菜籽餅是棉子、油菜籽榨油后剩下的餅狀殘渣,蛋白質(zhì)含量較高,含有各種氨基酸成分。但由于棉菜籽餅中含有植酸、芥子堿等物質(zhì),這些物質(zhì)含有一定的毒性,還會影響動物的消化吸收,不能大量使用,因此不建議直接飼喂給動物!

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現(xiàn)在通過微生物飼料發(fā)酵劑的除毒脫毒技術(shù),可以成功將菜籽餅變?yōu)閮?yōu)質(zhì)添加飼料,直接按照1公斤發(fā)酵的棉菜籽餅(發(fā)酵前的重量)代替約0.85公斤豆粕進(jìn)行使用。飼料發(fā)酵劑中的有益微生物,在發(fā)酵過程中分泌的代謝產(chǎn)物,可將棉菜籽餅中的毒性物質(zhì)等有效分解。

豆粕、菜粕、棉粕成分對比

1.豆粕是一種高蛋白原料,無需脫毒即可用作飼料。其中蛋白質(zhì)含量為40%-48%,賴氨酸含量為2.5%-3.0%,色氨酸含量為0.6%-0.7%,蛋氨酸含量為0.5%-0.7%。2020年11月12日報價每噸在3500元左右。

2.菜粕的粗蛋白含量在34%-38%之間,特點是蛋氨酸含量高(僅次于芝麻餅、粕),賴氨酸含量亦高。而精氨酸含量低,是餅、粕飼料中含量最低的。菜籽粕的有效能值偏低(淀粉含量低、菜籽殼難以消化利用)。礦物質(zhì)中,鈣和磷的含量均高,硒和錳的含量亦高。特別是硒的含量是常用植物飼料中最高的。2020年11月12日報價每噸在2900元左右。

3.棉粕蛋白質(zhì)含量一般為44.32%,僅次于豆粕的蛋白質(zhì)含量48%,而高于菜籽粕的蛋白質(zhì)含量36.04%。精氨酸含量高達(dá)3.6%-3.8%,而賴氨酸含量僅有1.3%-l.5%,只有豆粕的一半。2020年11月12日報價每噸在3000元左右。


是否需要脫毒處理

1.豆粕無需經(jīng)過脫毒即可用作飼料。而且豆粕中富含蛋白質(zhì)和多種氨基酸,在不需要額外加入動物性蛋白的情況下,僅豆粕中含有的蛋白質(zhì)和氨基酸足以平衡家禽和豬的食譜,促進(jìn)它們的營養(yǎng)吸收。只有當(dāng)其他粕類單位蛋白成本遠(yuǎn)低于豆粕時,豆粕才有可能被替代。

2.菜粕菜籽中含有硫葡萄糖苷、芥酸、單寧、皂角苷等不良成分,其中主要是硫葡萄糖苷。硫葡萄糖苷本身無毒,但在一定溫度和水分條件下,經(jīng)過菜籽本身含有的芥子酶的酶解作用而產(chǎn)生異硫氰酸酯、唑烷硫酮和腈類等有害物質(zhì)。這些物質(zhì)可引起甲狀腺腫大,從而造成動物生長速度下降,繁殖力減退。單寧則妨礙蛋白質(zhì)的消化,降低適口性。而芥酸阻撓脂肪代謝,造成心臟脂肪蓄積及生長受到抑制。。使用前需進(jìn)行一定的脫毒處理,并且使用時要加以限制,具體喂量應(yīng)根據(jù)菜粕中有害成分含量而定。經(jīng)過脫毒處理的菜籽粕喂量可以加大,而“雙低”油菜籽生產(chǎn)的菜粕喂量要受限制。同時,應(yīng)結(jié)合菜粕的氨基酸組成特點,適當(dāng)搭配其它餅粕。

3.棉籽中含有對動物有害的棉酚及環(huán)丙烯脂肪酸,尤其是棉酚的危害很大。在制油過程中,由于蒸炒,壓榨等熱作用,大部分棉酚與蛋白質(zhì)、氨基酸結(jié)合而變成結(jié)合棉酚,結(jié)合棉酚在動物消化道內(nèi)不被動物吸收,故毒性很小。另一部分棉酚則以游離形式存在于餅、粕及油品中,這部分游離棉酚對動物毒性較大,尤其單胃動物過量攝取或攝取時間較長,可導(dǎo)致生長遲緩、繁殖性能及生產(chǎn)性能下降,甚至導(dǎo)致死亡。幼小動物對棉酚的耐受能力更低。由于棉籽餅、粕中游離棉酚對動物有害,因此,在使用棉餅、粕時,要根據(jù)飼喂對象及餅粕中游離棉酚的含量加以限量。反芻家畜在有優(yōu)質(zhì)粗料及多汁青料的情況下,棉籽餅、粕的用量不受限制,不會造成中毒。對單胃動物要限制喂量,最好使用經(jīng)過脫毒處理的棉籽餅粕。同時,使用棉籽餅、粕配制飼糧要注意氨基酸平衡,尤其是棉籽餅、粕的賴氨酸含量低,且利用率差,應(yīng)注意添加賴氨酸。

發(fā)酵操作技術(shù)

發(fā)酵棉菜籽餅其實也是一個脫毒技術(shù),具體操作如下:

1.仔細(xì)檢查棉菜籽餅,剔除棉菜籽餅中嚴(yán)重變質(zhì)發(fā)霉的部分,輕度發(fā)霉的原料可以忽略,因為微生物發(fā)酵能夠脫霉。

2.將棉菜籽餅粉碎并添加適量的玉米粉淀粉類的能量飼料等,調(diào)節(jié)飼料營養(yǎng)比例。

3.每噸棉菜籽餅加入2公斤食鹽、玉米粉(其它淀粉、面粉次粉等也可以,或者粉碎的生紅薯300公斤也可以)100公斤、“99多功能飼料發(fā)酵劑”1包(500g/包,市場售價約25元,以高濃度乳酸菌、酵母菌、復(fù)合酶制劑的專業(yè)發(fā)酵劑)。

4.在混合物料中添加適量水分,使混合物料含水量保持在55%左右,以“手抓一把并緊握,無水滴落,松手后輕觸即散”為宜,一般上述配方中需要加入清水約500-600公斤。

5.發(fā)酵方式根據(jù)實際環(huán)境條件各異,在桶、缸、塑料袋等容器中發(fā)酵均可。

6.發(fā)酵時要盡可能排盡空氣進(jìn)行密封發(fā)酵。如果使用的發(fā)酵容器有密封不嚴(yán)實的隱患,要在一開始就在其外層包裹一層塑料袋并扎緊。發(fā)酵過程中不能啟封。

7.發(fā)酵時間受環(huán)境溫度影響,通常夏季發(fā)酵2-3天,冬季發(fā)酵5-7天即可完成。發(fā)酵完成后,有較為強(qiáng)烈的酸香味,ph值在3-4。

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規(guī)模運用混合發(fā)酵現(xiàn)場

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塑料缸、飼料袋(有內(nèi)膜)均可做發(fā)酵飼料

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采用池子發(fā)酵

發(fā)酵完成的棉菜粕飼喂動物技術(shù)

需要注意的是,發(fā)酵后的飼料酸度較低,不可以取代禽畜全部日糧。其他類發(fā)酵飼料同理。飼喂時根據(jù)不同情況,將發(fā)酵飼料按照一定比例添加到日糧中,發(fā)酵完成的棉菜粕為濕料,具體使用量每大概1.5-2公斤發(fā)酵棉菜粕(濕料)代替動物日糧配方中1公斤豆粕的使用量進(jìn)行代替使用,與其它飼料混合后直接飼喂,由于棉菜籽粕蛋白較高,最高使用量不要超過禽畜日糧飼喂量的40%(濕料重量)。如果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵飼料過酸適口性變差,可在飼喂前在陽光下曬1-2小時,或添加適量的碳酸氫鈉(小蘇打)即可改善。

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發(fā)酵過程中與發(fā)酵后使用過程中,發(fā)酵的容器要一直保持密封狀態(tài),可以長時間保存(一年左右)。

當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)成本高居不下,而飼料成本是其中最高的,利用廉價原料發(fā)酵飼料(包括一些輕度發(fā)霉的粕類低價收回)是極佳解決辦法。通過微生物飼料發(fā)酵劑的發(fā)酵作用,可以將輕度霉變飼料變成優(yōu)質(zhì)飼料,將不易消化的物質(zhì)分解為可被畜禽吸收的小分子糖類、氨基酸等。同時發(fā)酵飼料中富含有益微生物、酶制劑、酸化劑等,可調(diào)節(jié)畜禽腸胃微生態(tài)環(huán)境并進(jìn)一步提高飼料利用率。發(fā)酵飼料氣味清香,提高了飼料的適口性,加上發(fā)酵飼料中有大約4℃的酒度,能夠促進(jìn)動物新陳代謝促進(jìn)健康抵御疾病,是當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中重要的一環(huán)。

本技術(shù)也可以同樣發(fā)酵菜籽粕(餅)、棕櫚粕等,方法同上。

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