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導讀

益生菌是1 類能夠促進宿主腸內(nèi)微生物菌群的生態(tài)平衡， 對宿主健康及生理功能產(chǎn)生有益作用的活性微生物。本文就益生菌概念、發(fā)展歷史、在食品工業(yè)中的應用，尤其是在發(fā)酵果蔬中的關(guān)鍵技術(shù)及其應用進行綜述，探討益生菌發(fā)酵果蔬關(guān)鍵技術(shù)存在的主要問題及未來發(fā)展方向。

1益生菌的概念

益生菌一詞最先是由Lilly 和Stillwell 在1965 年使用的，他們把益生菌描述為1 種微生物產(chǎn)生的，可以刺激其他微生物生長的物質(zhì)，是與抗生素相反的物質(zhì)。1974 年Fark 定義為：益生菌是有利于腸道平衡的有機物質(zhì)， 這一定義將抗生素也包括在內(nèi)。1989 年Fuller 把益生菌定義為能夠促進腸內(nèi)菌群生態(tài)平衡， 對宿主起有益作用的活性微生物制劑， 這是目前人們最常用的定義。1994 年有人對益生菌的定義做了修訂：“益生菌是含活菌和死菌，包括其組分和產(chǎn)物的細菌制品，經(jīng)口或其他黏膜投入， 旨在改善黏膜表面微生物或酶的平衡， 或者刺激特異性或非特異性免疫機制”。2001 年，世界糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）將益生菌定義為：通過攝取適當?shù)牧?，對食用者的身體健康能發(fā)揮有效作用的活菌。目前在世界范圍內(nèi)，學者們對其定義還存在著爭議。與益生菌相近的術(shù)語包括微生態(tài)制劑、微生物生長促進劑、直接飼喂微生物等。有人認為益生菌可為單株，也可為多種菌株的發(fā)酵產(chǎn)物。目前普遍認為作為益生菌的細菌應具備以下條件：①對宿主有益；②無毒性作用和無致病作用；③能在消化道存活；④能適應胃酸和膽鹽；⑤能在消化道表面定植；⑥能夠產(chǎn)生有用的酶類和代謝物；⑦在加工和貯存過程中能保持活性； ⑧具有良好的感官特

性。

目前應用于食品的益生菌主要有乳桿菌（植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和嗜酸乳桿菌等）和雙歧桿菌（動物雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌和長雙歧桿菌等）。

2益生菌的發(fā)展歷史

自1899 年法國Tissier 博士發(fā)現(xiàn)第1株益生菌——雙歧桿菌以來， 人類對益生菌的研究已有100 多年的歷史。其間，各國科學家不斷對益生菌進行深入研究與探索。1900 年奧地利醫(yī)生莫落驗證了人的生老病死和腸道內(nèi)的微生物的密切關(guān)系。1908 年俄國科學家伊力亞·梅契尼科夫（Metchnikoff）指出大量發(fā)酵乳制品的攝入與保加利亞人的長壽密切相關(guān)。1930 年，醫(yī)學博士代田稔在日本京都帝國大學（現(xiàn)在的京都大學）醫(yī)學部的微生物學研究室首次成功地分離出來自人體腸道的乳酸桿菌，并經(jīng)強化培養(yǎng)，使它能活著到達腸內(nèi)。這株菌的命名引用代田博士的名字， 即L.casei strain shirota， 也是后來被稱為養(yǎng)樂多菌的益生菌。1935 年，乳酸菌飲料“養(yǎng)樂多”問世，益生菌開始走上產(chǎn)業(yè)化。1954 年Vergio 比較了腸內(nèi)微生物菌群抗生素與其他抗微生物物質(zhì)的主要作用， 首次介紹了益生菌。1965 年Lilly D. M.和Stillwell R. H.在《科學》雜志上發(fā)表的論文中最先使用益生菌Probiotic 這個定義來描述1 種微生物對其他微生物促進生長的作用， 首先提出了益生菌的概念， 即益生菌是指對平衡腸道菌群有益的物質(zhì)或微生物。1989 年英國福勒博士（Dr. Roy Fuller）將益生菌定義為：益生菌是額外補充的活性微生物， 能改善腸道菌群的平衡并對宿主的健康有益。他所強調(diào)的益生菌的功效和益處必須經(jīng)過臨床驗證。2001 年，F(xiàn)AO/WHO 對益生菌做了如下定義：通過攝取適當?shù)牧?，對食用者的身體健康能發(fā)揮有效作用的活菌。2005 年，美國北卡羅來納州立大學Dobrogosz 和Versalovic 教授提出了免疫益生菌的概念（Immunoprobiotics）。近年來，科學家相繼從健康人體腸道中分離出雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等多種益生菌株， 并通過大量的臨床試驗證實了益生菌維持腸道微生態(tài)平衡， 增強機體免疫力等多種其他正常生理菌群無法比擬的益生功能。目前，日本、法國、美國等國家的益生菌的基礎(chǔ)與應用研究較為專業(yè)化和系統(tǒng)性， 尤其日本與法國在益生菌研究與應用方面處于領(lǐng)先的地位。日本在20 世紀60年代開始使用益生菌，并較早形成了產(chǎn)業(yè)規(guī)模；以法國為代表的西歐從20 世紀70 年代開始陸續(xù)有益生菌上市。我國對益生菌及與微生態(tài)相關(guān)的基礎(chǔ)理論及應用的研究始于上個世紀50 年代，并于80 年代成立了微生態(tài)學的學會組織，隨后國內(nèi)市場上出現(xiàn)了麗珠腸樂膠囊、培菲康、媽咪愛等多種微生態(tài)制品。進入21 世紀以來，隨著人類生活節(jié)奏的日益加快， 人的飲食和生活習慣也發(fā)生了巨大改變， 腸道更易受到各種因素的影響而引發(fā)各類腸道疾病?？茖W家對益生菌的研究逐步趨向于輔助治療各類疾病， 以及益生菌調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、免疫調(diào)節(jié)機制、降低膽固醇、預防癌癥等方面， 更好地說明了益生菌對人類健康所發(fā)揮的巨大作用。

3益生菌在食品工業(yè)中的應用

乳制品是益生菌應用最多（高達70%），也是最為成熟的領(lǐng)域。早在1971 年，日本的MorinageMilk Industry 公司就開發(fā)了第1 款含有長雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的發(fā)酵乳制品。1978 年，Yakult 公司開發(fā)了含有短雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的液體酸奶，命名為MilMilTM。1987 年，美國Mayfield 公司生產(chǎn)出含有1%嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌的非發(fā)酵低脂乳。此后，法國、德國、丹麥等歐盟國家也致力于益生菌乳制品的研究與開發(fā)。

目前，益生菌在日本、歐美等發(fā)達國家已發(fā)展成為1 個高度成熟的產(chǎn)業(yè)， 并且開發(fā)出多款具有自主知識產(chǎn)權(quán)的國際知名益生菌株及益生菌乳制品，如丹麥Chr. Hansen 公司的BB12、嗜酸乳桿菌（L.acidophilus） LA-1 和LA-2 菌株，丹麥Danisco 公司的Howaru 系列菌株， 德國Biogaia 公司的羅伊氏乳桿菌（L. reuteri）SD2112、MM2 菌株， 芬蘭Valio 公司的LGG 菌株等以及雀巢公司的LC1 優(yōu)酪乳和媽咪go，瑞士EMMI 公司的Aktifit Plus，達能公司的Activia，荷蘭康必奶公司的Vifit，日本的養(yǎng)樂多等。在益生菌產(chǎn)品技術(shù)開發(fā)方面，我國與歐美等國家尚存在差距。近年來隨著益生菌市場的不斷壯大， 篩選國產(chǎn)益生菌種并進行工業(yè)化應用研究，正在逐漸受到國內(nèi)科技界和企業(yè)界的重視。內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學張和平課題組經(jīng)多年研究， 選育出包括干酪乳桿菌（L. casei Zhang）、乳酸雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis） V9、瑞士乳桿菌（L.helveticus）H9 等多株具有優(yōu)良功能的益生菌株，實現(xiàn)了具有自主知識產(chǎn)權(quán)功能性益生菌株的重要突破，并與內(nèi)蒙古伊利集團合作，成功將L. casei Zhang 應用于多種活性乳酸菌飲料的生產(chǎn)。江南大學陳衛(wèi)課題組在建立功能性益生乳酸菌篩選模型的基礎(chǔ)上， 篩選出多株擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的益生乳酸菌，開發(fā)了含有功能性益生菌的發(fā)酵乳制品， 并在光明乳業(yè)股份有限公司實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。哈爾濱工業(yè)大學張?zhí)m威課題組針對國內(nèi)乳品行業(yè)優(yōu)良菌株缺乏， 產(chǎn)品中所用菌株生理功效無法得到保證這一問題，聯(lián)合蒙牛乳業(yè)集團，選育出了1 株在生產(chǎn)性能方面表現(xiàn)出獨特性質(zhì)的高產(chǎn)胞外多糖的嗜熱鏈球菌，并開發(fā)出具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的乳品發(fā)酵劑， 這對后續(xù)研發(fā)適合我國工業(yè)化生產(chǎn)以及開發(fā)功能更加完善的特色酸奶產(chǎn)品意義重大。除益生菌酸奶和發(fā)酵乳飲料外，近年來益生菌正在逐步被用于開發(fā)嬰幼兒奶粉、冰淇淋、冷凍酸奶等各種功能性食品中。隨著我國益生菌研究的深入以及乳品業(yè)市場競爭的需要，今后勢必會有越來越多國內(nèi)自主研發(fā)的特色益生菌株用于益生菌高端產(chǎn)品的開發(fā)。

益生菌對人體腸道功能和免疫調(diào)節(jié)帶來的良好作用已得到廣泛的認同， 這為益生菌的發(fā)展提供了良好的機會。近年來隨著益生菌市場的逐漸壯大，益生菌的應用范圍不斷擴大。目前，在全球范圍內(nèi)，益生菌被廣泛運用到乳制品、肉制品、發(fā)酵果蔬、發(fā)酵谷物以及保健品行業(yè)中，產(chǎn)品形式擴展到片劑、膠囊、顆粒狀包裝的菌體、凍干菌粉以及發(fā)酵乳或果蔬的干燥和凍干粉劑等等， 并逐步形成相對成熟的市場，銷量逐年上升，應用范圍不斷擴大。根據(jù)市場調(diào)研機構(gòu)BCC 公司發(fā)布的1 份新的市場研究報告——益生菌市場：原料、補充劑及食品顯示：2007 年，全球益生菌原料、補充劑及食品的市場規(guī)模達到149 億美元，2008 年達到159 億美元，到2013 年達到196 億美元，年均復合增長率（CAGR）為4.3%。由此可見益生菌市場發(fā)展勢頭之強勁。在過去的十幾年里，中國的益生菌市場從無到有，從單一產(chǎn)品發(fā)展到多元化產(chǎn)品，逐漸形成了一定的規(guī)模， 并一步步走向?qū)I(yè)化和產(chǎn)業(yè)化。

4益生菌在發(fā)酵果蔬中的應用

益生菌在發(fā)酵果蔬中的應用可追溯到上個世紀的60 年代。Pederson 等在1961 年率先將純種發(fā)酵接種技術(shù)應用于泡菜的研究。隨后，加拿大考德威爾生物發(fā)酵股份有限公司（Caldwell Bio Fermentation Canada lnc）在1998 年獲得了復合菌種接種發(fā)酵蔬菜的專利技術(shù)。2001 年，Nancy JGardner 等將植物乳桿菌NK-312、乳酸片球菌AFERM772 和腸膜明串珠菌BLAC 進行凍干后復配，用于胡蘿卜、甘藍、甜菜和洋蔥混合蔬菜的復配發(fā)酵菌劑試驗。Rodríguez-Gómez 等采用由兩種戊糖乳桿菌復配而成的復合發(fā)酵劑發(fā)酵西班牙綠橄欖，取得了良好的效果。我國李幼筠等在1996 年分離出干酪乳桿菌和短乳桿菌， 開發(fā)出1種利用純種乳酸菌生產(chǎn)泡菜的工藝， 并申請了發(fā)明專利。西南大學等單位篩選出的純種乳酸菌菌種可使四川泡菜的發(fā)酵周期由傳統(tǒng)工藝的25d縮短為2d。蔡永峰等在2004 年開發(fā)了1 種用于生產(chǎn)泡菜的直投式復合菌粉產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法，并獲得了發(fā)明專利。隨著益生菌蔬菜發(fā)酵劑研究日漸深入， 國內(nèi)外越來越多的發(fā)酵蔬菜生產(chǎn)企業(yè)開始采用直投式發(fā)酵劑生產(chǎn)泡菜， 給發(fā)酵蔬菜行業(yè)的發(fā)展帶來了可喜的增長。大宗蔬菜的益生菌高效發(fā)酵技術(shù)不僅從根本上解決了傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜存在的食品安全問題，穩(wěn)定了產(chǎn)品質(zhì)量，而且大大縮短了泡菜的發(fā)酵周期（將傳統(tǒng)的15～60 d 發(fā)酵周期縮短至2 d 內(nèi)），提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本。益生菌發(fā)酵泡菜產(chǎn)品酸鮮可口， 營養(yǎng)豐富，天然風味濃郁，具有良好的保健功能（富含益生菌和天然植物化學物）。

近年來，隨著果蔬深加工技術(shù)的發(fā)展，人們對益生菌發(fā)酵果蔬產(chǎn)品認識的不斷深入， 關(guān)于益生菌用于果蔬汁飲料加工中的研究報道也在不斷增多。采用益生菌生物發(fā)酵技術(shù)開發(fā)具有特殊營養(yǎng)保健功能的發(fā)酵果蔬汁飲料， 是果蔬深加工技術(shù)的延伸，不僅可以改善果蔬制品的風味，增加果蔬制品的醫(yī)療保健作用， 而且大大豐富了果蔬制品的花色品種， 解決了制約果蔬加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。日本、韓國、德國等一些國家都進行了發(fā)酵蔬菜汁的研究與開發(fā)，尤其是日本，大力開發(fā)蔬菜飲料市場，并形成了良好的發(fā)展態(tài)勢。2001 年，日本大制藥公司開發(fā)出1 款名為“蔬菜的戰(zhàn)士”的植物性乳酸菌發(fā)酵蔬菜汁飲料產(chǎn)品，其中有大蒜、甘薯、南瓜、西紅柿等富含胡蘿卜素的8 種蔬菜，風味獨特，且營養(yǎng)豐富，頗受市場歡迎。2010 年，瑞典Skane 公司推出了1 種益生菌果汁， 有醫(yī)學證據(jù)表明其所含的益生菌可以促進女性對鐵的吸收。Kyung 等以甘藍汁為原料，接種干酪乳桿菌、植物乳桿菌保加利亞乳桿菌，于30 ℃溫度下發(fā)酵48 h 后， 獲得了含有大量活性益生菌，并且可以緩解乳糖不耐癥的發(fā)酵甘藍汁。Gardner 等采用胡蘿卜、甘藍、洋蔥和甜菜的混合果蔬汁分別接種植物乳桿菌、乳酸片球菌、腸膜明串珠菌的單菌及其組合物進行發(fā)酵， 有效提高了蔬菜汁的風味口感及安全性和耐貯藏性。Filannino 等選用植物乳桿菌接種有機石榴汁， 開發(fā)出1 款風味和健康功效俱佳的發(fā)酵石榴汁產(chǎn)品。據(jù)報道， 自2005 年至今， 全球大約80 多個發(fā)酵果蔬汁新產(chǎn)品上市，主要集中在日本市場。近年來，國內(nèi)外關(guān)于乳酸菌發(fā)酵果蔬汁飲料的研究也逐漸增多。張建華的混濁型菜汁飲料是采用保加利亞桿菌、嗜熱乳菌鏈球菌混合，在接種量2%～3%、溫度40℃、脫脂乳含量4%、發(fā)酵16 h 的發(fā)酵模式下生產(chǎn)。張亞雄等采用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌種進行單一果蔬汁及復合果蔬汁發(fā)酵制作果蔬乳酸發(fā)酵飲料及果蔬乳酸發(fā)酵型果凍。夏其樂等以楊梅為主要原料，復配胡蘿卜、番茄榨汁后添加保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌進行發(fā)酵，并確定了最佳的發(fā)酵工藝及果汁混合方式。鄒玉紅等以保加利亞乳酸桿菌和嗜熱酸鏈球菌混菌比例1∶1 發(fā)酵蘋果、胡蘿卜混合果汁，并對發(fā)酵飲料的生產(chǎn)工藝進行了研究。戈西賽夫等在專利“發(fā)酵蔬菜汁飲料的生產(chǎn)方法及用此方法生產(chǎn)的蔬菜發(fā)酵飲料” 中將多種干燥脫水的蔬菜粉末的混合物漿化、液化、糖化、脫膠，通過接種保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵， 得到適于飲用的蔬菜發(fā)酵飲料。丘裕選用南瓜和火龍果為原料，干酪乳桿菌及植物乳桿菌為菌種， 研究了益生菌在兩種果蔬汁中的發(fā)酵特性以及發(fā)酵果蔬汁在冷藏條件下的穩(wěn)定性。

5益生菌發(fā)酵果蔬關(guān)鍵技術(shù)研究

5.1 發(fā)酵果蔬中微生物的研究

上個世紀80 年代，美國Fleming課題組為更好地指導以圓白菜為原料的酸菜規(guī)模化生產(chǎn)，對自然發(fā)酵酸菜微生物區(qū)系進行了研究， 結(jié)果表明以圓白菜為原料的酸菜發(fā)酵包括初始異型發(fā)酵和后續(xù)同型發(fā)酵兩個階段， 發(fā)酵過程中的主體微生物為乳酸菌。Fleming課題組通過對酸菜發(fā)酵微生物的動態(tài)研究， 發(fā)現(xiàn)抑制酸菜發(fā)酵過早進入同型發(fā)酵階段可避免酸菜過酸， 并產(chǎn)生更多的風味物質(zhì)。據(jù)此他們篩選了用于酸菜工業(yè)化生產(chǎn)的接種劑——Leuc.mesenteroides 或以 Leuc.mesenteroides為主的復合微生物?，F(xiàn)已進入泡菜工業(yè)化生產(chǎn)成熟期的韓國， 對發(fā)酵蔬菜中微生物的研究也有很長的歷史。Lee 課題組采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對Kimchi 發(fā)酵過程中微生物的動態(tài)變化的分析表明，包括Leuc.mesenteroides，Leuc.gelidum，Leuc.citreum 在內(nèi)的異型發(fā)酵乳酸菌Leuconostoc 在Kimchi 發(fā)酵初期占優(yōu)勢；在發(fā)酵后期，Lact.curvatus，Lact.Brevis 及Lact.plantarum 等在內(nèi)的乳酸菌（Lactobacillus）迅速生長，取代其優(yōu)勢地位。后來Lee 等又采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術(shù)， 發(fā)現(xiàn)魏斯氏菌屬（Weissella） 的幾個種也是Kimchi 中的主要發(fā)酵類群。綜合眾多的研究結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，Leuc.mesenteroides 這種異型發(fā)酵乳酸菌是Kimchi 發(fā)酵過程中的主要功能乳酸菌，將其應用于發(fā)酵可以很好地改善產(chǎn)品的風味。目前，韓國的很多企業(yè)已將其作為接種劑應用于工業(yè)化生產(chǎn)。Paramithiotis 等采用PCR-DGGE 技術(shù)對西班牙蘆筍自然發(fā)酵過程中微生物的動態(tài)變化進行了分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前5 d 清酒乳桿菌（L.sakei）和糞腸球菌（Enterococcus faecium）為優(yōu)勢菌群，而綠色魏斯氏菌（W.viridescens）和食竇魏斯氏菌（W.cibaria）主導后期發(fā)酵。

可見， 對于發(fā)酵微生物區(qū)系進行系統(tǒng)深入的研究，可以促進相關(guān)產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；l(fā)展。作為國內(nèi)長期致力于發(fā)酵果蔬研究的課題組， 筆者首次解析了我國傳統(tǒng)自然發(fā)酵泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌的動態(tài)變化規(guī)律， 發(fā)現(xiàn)腸膜明串珠菌腸膜亞種啟動整個發(fā)酵， 隨后是糞腸球菌、乳酸乳球菌乳酸亞種、玉米乳桿菌出現(xiàn)并參與發(fā)酵，最終植物乳桿菌和干酪乳桿菌終止發(fā)酵過程。此外，還對泡菜發(fā)酵過程中主要發(fā)酵菌株的生長代謝機制及其發(fā)酵功能進行了深入研究， 初步闡明泡菜發(fā)酵中存在的多菌種協(xié)同發(fā)酵的代謝控制機理。筆者課題組在發(fā)酵果蔬微生物的研究中， 選育出1 批植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、腸膜明串珠菌、羅伊氏乳桿菌等具有優(yōu)良果蔬發(fā)酵特性的乳酸菌株，經(jīng)初步的益生功能評價后，將這些優(yōu)良菌株搭配用于傳統(tǒng)泡菜的發(fā)酵，其發(fā)酵周期、乳酸產(chǎn)量、感官評價等各方面都要優(yōu)于自然發(fā)酵。將菌株搭配接種于胡蘿卜汁等果蔬汁中發(fā)酵， 發(fā)酵后的果蔬汁中不僅增加了大量的營養(yǎng)成分，還形成了很好的風味。這些研究為我國果蔬發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定了重要的理論基礎(chǔ)。

5.2 高活性、低成本的益生菌劑關(guān)鍵技術(shù)研究

5.2.1 益生菌菌體高密度培養(yǎng)技術(shù)

益生菌菌體高密度培養(yǎng)技術(shù)（high cell density culture，HCDC）主要指應用一定的培養(yǎng)技術(shù)和裝備來提高單位培養(yǎng)液中益生菌菌體的密度， 并較普通培養(yǎng)方式有顯著提高。1991 年Riesenberg曾指出，理論上大腸桿菌充滿發(fā)酵液的時候，按照菌體干20%～25%來計算， 菌體最高的密度將達到400 g 細胞干重/L。外界環(huán)境對益生菌菌體的生長代謝有著至關(guān)重要的影響， 無論是培養(yǎng)基質(zhì)的組成還是溫度、pH值、溶氧量亦或是菌體生長過程的限制性代謝產(chǎn)物積累等因素， 都極大地限制了細菌在培養(yǎng)基質(zhì)中的最大生長密度。例如乳酸菌在一般的培養(yǎng)基質(zhì)中能夠達到的最高活菌數(shù)僅為107～108CFU/mL，而向培養(yǎng)基質(zhì)中加入適當?shù)木彌_鹽調(diào)節(jié)培養(yǎng)基質(zhì)的酸度， 可使乳酸菌在基質(zhì)中的活菌數(shù)達到109CFU/mL。1977年Osborne首次使用透析技術(shù)得到10×1010CFU/mL 的活菌數(shù)（相當于30～40 g細胞干重/L）， 而其膜面積耗水量約0.6 m⊃3;/kg。1989 年汪恩浩用國產(chǎn)中空纖維超濾裝置培養(yǎng)的乳酸菌濃度達到分批培養(yǎng)的17 倍。1997 年Karah在透析反應器聯(lián)合透析模塊的反應器中用分批培養(yǎng)的方法得到細菌密度高達100 g/L。目前國外對乳酸菌的高密度培養(yǎng)技術(shù)研究通常采用專門設計的生物反應器， 采用半透膜與發(fā)酵罐偶聯(lián)技術(shù)， 不斷除去發(fā)酵過程中積累的限制性代謝產(chǎn)物——乳酸，并將菌體保留在發(fā)酵罐中，實現(xiàn)菌體的循環(huán)培養(yǎng)，其最高菌體密度可達到1011CFU/mL， 然而此透析培養(yǎng)方法需要消耗大量培養(yǎng)基，僅限于實驗室水平， 很難擴大并運用到工業(yè)生產(chǎn)中。目前國內(nèi)主要采取培養(yǎng)基成分優(yōu)化結(jié)合分批培養(yǎng)或者補料流加培養(yǎng)的方式來達到乳酸菌高密度培養(yǎng)的目的， 由此得到的乳酸菌菌體密度一般在109～1010 CFU/mL。筆者課題組采用均衡營養(yǎng)、指數(shù)流加等培養(yǎng)方法，植物乳桿菌大罐發(fā)酵活菌數(shù)達到1.9×1010CFU/mL。內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學張和平課題組采用分批培養(yǎng)方法得到L.casei Zhang最高活菌數(shù)為3.5×1010CFU/mL。吉林大學王智鼎等在優(yōu)化鼠李糖乳桿菌LGG 培養(yǎng)基配方后，得到活菌數(shù)為9.4×109CFU/mL。寧波大學曾小群等采用補料分批培養(yǎng)的方法，得到戊糖乳桿菌活菌數(shù)為2.36×1010CFU/mL。目前高密度培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應用于益生菌發(fā)酵劑的生產(chǎn)， 不僅增加了單位體積培養(yǎng)液中的菌體數(shù)量， 而且提升了現(xiàn)代化發(fā)酵進程，加速了益生菌發(fā)酵劑的商品化進程，對于實現(xiàn)益生菌發(fā)酵果蔬技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化推廣具有重要而深遠的意義。

5.2.2 高活性、低成本益生菌劑制備技術(shù)

益生菌高密度培養(yǎng)技術(shù)的建立為后續(xù)高活性益生菌制劑的制備打下良好的基礎(chǔ)。對益生菌制劑的評價除了具備優(yōu)良的益生功能和發(fā)酵活性， 還要確保益生菌制劑在加工、貯藏和運輸過程中的穩(wěn)定性能，并在最大程度上保證菌體的活性。高活性益生菌制劑的制備要在保持益生菌活性的同時， 盡量移除環(huán)境中的活性水分。除去益生菌所在環(huán)境中活性水分的方法主要有噴霧干燥法和真空冷凍干燥法。噴霧干燥技術(shù)是采用霧化器將濃縮益生菌菌懸液在干燥室內(nèi)造霧， 同時經(jīng)鼓入的熱空氣與之接觸，瞬間將霧滴中含有的水分帶走。噴霧干燥的效果受進風溫度影響比較大， 若采用進風低溫（40～80 ℃）， 設備利用率和干燥程度都大大降低；若采用較高進風溫度（80～140 ℃），絕大部分的益生菌尤其是乳酸菌無法承受高溫， 益生菌干燥粉的活性將大大降低， 報道顯示國內(nèi)外使用噴霧干燥技術(shù)制備的細菌制劑存活率僅有2%～50%。

雖然噴霧干燥的處理效率高于真空冷凍干燥技術(shù)， 但是國內(nèi)外還沒有1 種良好的方法能夠解決這一問題， 使得益生菌菌劑的制備都傾向于真空冷凍干燥技術(shù)。高活性益生菌菌劑的制備使得真空冷凍干燥技術(shù)逐漸變得熱門。現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)出規(guī)?；纳a(chǎn)工藝來滿足日益增加的高活性益生菌菌劑的市場需求。目前使用真空冷凍干燥技術(shù)制備益生菌菌劑的成活率一般都在80%左右。

真空冷凍干燥技術(shù)制備益生菌菌劑時不可避免地形成冰晶，對菌體活性也有一定影響。目前國內(nèi)外文獻報道中， 一般使用冷凍保護劑來保護低溫環(huán)境中的活菌體。該保護劑可以改變細菌樣品冷凍干燥時的物理、化學環(huán)境，減輕或防止冷凍干燥和復水對菌體的損傷， 同時提高菌劑貯藏和運輸?shù)姆€(wěn)定性。報道中使用的冷凍保護劑主要有多元醇、糖、蛋白質(zhì)、肽及氨基酸等。潘艷等的試驗表明，海藻糖、谷氨酸鈉、蔗糖、山梨醇和乳糖對植物乳桿菌的保護作用最為突出， 乳酸菌存活率達到78.9%。潘曉琳等在優(yōu)化了7 種保護劑后，存活率可達到86%。乳酸菌等益生菌凍干菌粉活菌數(shù)基本在1010CFU/g 左右， 且凍干時間一般需要30 h 以上。筆者課題組采用專利“1 種兩步干燥法生產(chǎn)高活性乳酸菌劑的方法”，在真空冷凍干燥之前將制備好的乳酸菌菌泥置于真空干燥箱中真空干燥，真空度保持在500 Pa 以下，真空干燥溫度25～45 ℃，真空干燥4 h，然后再真空冷凍干燥。該發(fā)明可顯著縮短真空冷凍干燥時間，降低能耗，從而有效節(jié)約菌劑制備的成本。此外，菌體的存活率也大大提高， 生產(chǎn)放大后菌劑的活菌數(shù)可達2.6×1012CFU/g。這項發(fā)明對制備低成本高活性益生菌劑具有重要意義。

6問題與展望

益生菌在果蔬精深加工中的應用以往僅限于生產(chǎn)泡菜。近年來，隨著食品科學的發(fā)展，益生菌發(fā)酵也逐漸被應用于果蔬飲料的生產(chǎn)。值得注意的是， 我國的益生菌發(fā)酵果蔬關(guān)鍵技術(shù)研究尚存在諸多問題。首先，目前益生菌發(fā)酵果蔬汁飲料多處于實驗室研究階段， 用于果蔬發(fā)酵的乳酸菌多為牛奶發(fā)酵菌株， 而較少采用植物乳桿菌等植物性乳酸菌。由于牛奶發(fā)酵菌株利用果蔬產(chǎn)酸的能力有限且耐酸性很差， 因此不能夠有效地發(fā)酵果蔬原料產(chǎn)生良好的風味和營養(yǎng)物質(zhì)， 這就使得現(xiàn)有乳酸菌發(fā)酵果蔬產(chǎn)品風味不夠純正。開發(fā)出具有優(yōu)良發(fā)酵性能的果蔬發(fā)酵專用菌株并用于發(fā)酵果蔬汁飲料，是該產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢。其次，盡管近年來國內(nèi)外對果蔬發(fā)酵乳酸菌的分離鑒定和一般生物學特性做了不少研究， 其中是否還存在具有開發(fā)潛力的益生菌菌株以及如何將這些益生菌菌株應用于發(fā)酵果蔬的生產(chǎn)， 是亟待開展的研究課題。在果蔬發(fā)酵專用菌的篩選方面，應逐步將高效篩選技術(shù)與科學的體內(nèi)功能性評價體系相結(jié)合， 選育既有優(yōu)良果蔬發(fā)酵特性又有利于人體腸道微生態(tài)平衡的功能性果蔬發(fā)酵專用益生菌株。

此外，在果蔬發(fā)酵劑方面，目前可以用于果蔬發(fā)酵的功能性益生菌發(fā)酵劑產(chǎn)品較少，且活性較低，仍需對直投式發(fā)酵劑制備中的關(guān)鍵技術(shù)進行深入研究，進一步開發(fā)出低成本、高活性的發(fā)酵果蔬專用益生菌制劑。最后， 要提高發(fā)酵果蔬制品的穩(wěn)定性，加快方便功能型益生菌發(fā)酵果蔬食品的研發(fā)，大力推進益生菌發(fā)酵果蔬制品的產(chǎn)業(yè)化。