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導(dǎo)讀

隨著養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的大規(guī)模發(fā)展，大量增加的豬場糞便等對自然界已經(jīng)造成嚴(yán)重污染，如果不立即采取措施，將會制約養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。以前的集約化和工廠化養(yǎng)殖已不能更有效地滿足人類需求，而推廣的生態(tài)養(yǎng)殖床養(yǎng)殖技術(shù)，是實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖業(yè)又好又快發(fā)展的重要措施。

至上世紀(jì)90 年代開始，為使豬肉的品質(zhì)和生產(chǎn)性能有大的提高，中外學(xué)者對生態(tài)發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)做了很多的研究 。目前我國農(nóng)村也大力提倡生態(tài)發(fā)酵床養(yǎng)殖技術(shù)，即將多種類的有益微生物比如酵母菌、放線菌、枯草芽孢桿菌等按照比例同木屑及輔助材料混合發(fā)酵，然后將形成的有機(jī)墊料鋪墊在養(yǎng)殖圈中，當(dāng)動物排泄的糞便被有機(jī)墊料吸收后，墊料中的微生物會迅速降解其中的微生物，從而達(dá)到無臭味和無害化的目的。

將生態(tài)發(fā)酵床養(yǎng)殖與集約化、工廠化養(yǎng)殖相比較后得出，生態(tài)發(fā)酵床養(yǎng)殖技術(shù)遵循畜禽在自然環(huán)境下按照自身原來的生長發(fā)育規(guī)律生長，而非人為地制造生長環(huán)境讓畜禽違反自身原有的生長規(guī)律快速生長。發(fā)展生態(tài)發(fā)酵床養(yǎng)殖技術(shù)對于改善人們的生活質(zhì)量和滿足市場需求等都有非常重要的意義，并且能最大限度地節(jié)約自然資源，在生產(chǎn)無公害綠色和有機(jī)食品方面有較大的應(yīng)用前景。

生態(tài)發(fā)酵養(yǎng)殖床中含有復(fù)合菌類，本文對其中的細(xì)菌進(jìn)行研究，鑒定其屬于那個菌種 。根據(jù)各種菌的培養(yǎng)特性，對各種營養(yǎng)成分的分解能力研究制作發(fā)酵床所需要的條件，使生態(tài)養(yǎng)殖床發(fā)酵技術(shù)有更好的發(fā)展前景。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑及藥品

革蘭染色試劑，甲基紅試劑，吲哚試劑，過氧化氫，淀粉，明膠，碘，蒸餾水等 。

1.1.2 儀器及器材

AB204 － S 電子分析天平，HH － S6 數(shù)顯恒溫水浴鍋，ＲAYW － 16 無菌涂布器，佩特里氏 630125 培養(yǎng)皿，YNK － 03 － 00 鎳洛合金接種環(huán)，DW － 9 型自動培養(yǎng)基分裝器，DYML － S30C 高壓蒸汽滅菌鍋，p H240 恒溫培養(yǎng)箱，LWK500LT 光學(xué)顯微鏡，DFT － 200 小型高速粉碎機(jī) 等 。

1.2 芽孢桿菌的培育篩選

1.2.1 材料來源

用于分離菌種的樣品采自蘭州市榆中縣夏官營鎮(zhèn)地表層的土壤 。用已滅菌的鏟子取土壤表層 10cm 下的土樣，將采得的樣品土壤放入已滅菌的紙袋里，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌種的分離 。

1.2.2 方法

1.2.2.1 稀釋涂布平板法分離

將采集的 10 g 土樣加入到有 90 m L 蒸餾水的有玻璃珠的三角瓶中，緩慢晃動三角瓶使其中的土?；靹?，然后靜置，吸取其中的上清液 1 m L 到無菌的試管中 。然后加入蒸餾水配制成 10－ 2濃度的懸液，再依次稀釋成 10－ 3、10－ 4、10－ 5濃度的懸液，將此四個梯度各取 0.2 m L 加到p H 為 10 的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿中，使用無菌的玻璃棒進(jìn)行涂布，然后放入 37 ℃ 的恒溫箱中培養(yǎng) 2 ～ 3 d。

1.2.2.2 菌株的篩選

分別挑取菌落從上述平板上分離的部分菌體，在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線進(jìn)行分化，重復(fù)多次挑取篩選就可得到該菌株的純種菌種 。將采用此法得到的該菌的 6 株菌分別標(biāo)號為 1、2、3、4、5、6 號菌株。

1.2.3 芽孢桿菌菌種的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)特征

個體形態(tài): 菌體經(jīng)過革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌的形狀并測定其大小; 用芽孢染色法在光鏡下觀察芽孢的形狀、著生位置等 。

群體形態(tài)觀察: 將 1 ～ 6 號菌株分別劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，37 ℃ 培養(yǎng) 2 ～ 3 d，于營養(yǎng)培養(yǎng)基上接一環(huán)菌懸液涂勻后，37 ℃培養(yǎng) 24 h、48 h，分別革蘭染色觀察結(jié)果。

1.2.3.2 生化試驗(yàn)

使用革蘭氏染色顯示陽性的菌株進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、明膠試驗(yàn)、淀粉試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)來確定最終篩選的菌株的類型。

1.3 酵母菌的分離篩選

1.3.1 材料

在附近超市購買發(fā)酵傳統(tǒng)面粉的發(fā)酵劑 。

1.3.2 方法

1.3.2.1 酵母菌增菌培養(yǎng)

用天平稱取 2 g 樣品，在無菌條件下加至 p H 值為 4.0 的麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基中，30 ℃ 下培養(yǎng) 48 h。

1.3.2.2 酵母菌的分離與篩選

采用劃線法將上述酵母菌增菌液接種到pH為 4 的麥芽汁瓊脂板上，然后 30 ℃條件下培養(yǎng) 24 h，再從中挑出單個菌落接種到麥?zhǔn)瞎腆w培養(yǎng)基的斜面上，培養(yǎng)結(jié)束后將待鑒定的菌株置于 4 ℃的冰箱中。

1.3.3 酵母菌菌種的鑒定

1.3.3.1 形態(tài)及菌落特征觀察

將待鑒定的菌株接種于麥芽汁固體培養(yǎng)基，30 ℃ 條件下培養(yǎng) 3 d 后觀察。

1.3.3.2 生化試驗(yàn)

1.3.3.2.1 糖發(fā)酵試驗(yàn)

在培養(yǎng)皿中分別加入糖發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，然后滅菌加入 10% 的糖液，并使糖濃度達(dá)到 2%，篩選編號為 A、B、C、D、E 的菌株接種到 30 ℃的培養(yǎng)基中倒置培養(yǎng)，培養(yǎng) 7 d 后判定結(jié)果。

1.3.3.2.2 不同 p H 值對酵母菌生長的影響

將酵母菌接種到 p H 分別為 4.0，5.2，6.4 的麥芽汁固體培養(yǎng)基上，在 30 ℃ 條件下培養(yǎng) 3 d，并且定期測量觀察菌落的大小。

1.3.3.2.3 不同溫度對酵母菌生長的影響

將培育篩選的菌株分別在 37 ℃和 30 ℃條件下培養(yǎng)，定時觀察形態(tài)和測量菌落大小。

2結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌的鑒定

2.1.1 形態(tài)特征

在營養(yǎng)瓊脂平板上，菌落粗糙半透明，灰白色或乳白色( 如圖1) ，再通過革蘭氏染色鏡觀察芽孢桿狀呈革蘭陽性，菌端呈鈍圓或平 。每個細(xì)胞只有一個芽孢，單個或鏈狀排列，無莢膜以周鞭毛運(yùn)動，芽孢囊不明顯膨大( 如圖2) 。

2.1.2 生化特征鑒定

2.1.2.1 芽孢桿菌生化試驗(yàn)的分析( 見表1)

本試驗(yàn)對土壤中分離得到的6株芽孢桿菌進(jìn)行屬的鑒定，結(jié)果見表1。由表 1 可以看出，革蘭氏染色試驗(yàn)和甲基紅試驗(yàn)、過氧化氫試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、淀粉試驗(yàn)和明膠試驗(yàn)均為陽性。根據(jù)形態(tài)特征和常規(guī)的生化鑒定結(jié)果將分離出的6株菌株確定為芽孢桿菌 。

2.1.2.2 芽孢桿菌糖發(fā)酵特性的鑒定( 見表 2)

將分離到的 5 株芽孢桿菌屬的菌株，進(jìn)一步做糖發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果如表 2 所示。由表 2 可知 5 株菌是同一種菌種，鑒定為芽孢桿菌。

2.2 酵母菌的鑒定

2.2.1 細(xì)胞形態(tài)及培養(yǎng)特征觀察結(jié)果

培養(yǎng)基菌落大而且厚，呈乳白色、土黃色，圓形，表面光滑濕潤，黏稠且扁平，邊緣整齊( 如圖 3) 。革蘭氏染色鏡檢觀察細(xì)胞呈圓形 。培養(yǎng)過程中呈多樣性，增殖方式為芽殖，且為一端芽殖，細(xì)胞核清晰，細(xì)胞間無雜質(zhì)碎片( 如圖 4) 。

2.2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2.1 糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2.2 不同 p H 值對酵母菌生長的影響

從表 4 可以看出，p H 值為 4. 0 時酵母菌在 24 h 內(nèi)基本沒有生長 。從培養(yǎng) 3 d 的生長總體結(jié)果看，p H 值為 5. 2 時比 p H 值為 4. 0 和 6. 4 時的各階段菌株的生長情況更好些 。

2.2.2.3 不同溫度對酵母菌生長的影響

從表 5 可以統(tǒng)計(jì)出，相同時間內(nèi) 37 ℃條件下酵母菌的生長速度比 30 ℃時生長速度快。

3討論

3.1 芽孢桿菌和酵母菌的討論

芽孢桿菌生長溫度范圍在 15 ～ 40 ℃，其中最適生長溫度為 30 ～ 37 ℃，最適 p H 范圍為 7.2 ～ 7.4，它的營養(yǎng)要求不高，在普通瓊脂培養(yǎng)基中就可生長，培養(yǎng) 24 h 就能看見灰白色表面干燥邊緣粗糙的菌落并且形成芽孢 。雖然在普通培養(yǎng)基中不形成莢膜，但是在血清瓊脂或者碳酸氫鈉瓊脂上，于 10% ～20% 的CO2條件下培養(yǎng)就可以形成莢膜 。因此，生態(tài)養(yǎng)殖中其內(nèi)含有芽孢桿菌可以分解纖維素等，這樣就不需要清除圈內(nèi)家畜的糞便，可自動分解且不污染環(huán)境，再者豬還可以啃吃發(fā)酵床墊料，減少飼料的耗量，也可以提高飼料消化率 。

酵母菌含有豐富的蛋白質(zhì)，可以幫助消化，在生長過程中可以形成多種 B 族維生素，這有助于其他微生物和動物的吸收和生長 。它含有超氧化物歧化酶( SOD)。SOD 是動物體內(nèi)銅、鋅、鐵、錳的氧化酶，可以消除動物體內(nèi)氧的自由基，解除游離氧對 O2-的毒性作用 。所以生態(tài)養(yǎng)殖中，發(fā)酵床含有酵母菌，在動物啃吃了墊料后，體內(nèi)酵母菌增加，對機(jī)體有益，可以更好的生長 。另外，酸化培養(yǎng)基一般用磷酸或鹽酸，因?yàn)橛袡C(jī)酸在 pH 值為 3.5 ～ 4.0 時僅有部分能解離，對多數(shù)酵母菌而言大量未解離的酸是有害的 。

酵母菌通常接種在液體培養(yǎng)基中，通過測定培養(yǎng)液的混濁度來研究酵母菌的生長狀況 。本文分離的菌株將用于生態(tài)養(yǎng)殖發(fā)酵床的研究，因此試驗(yàn)設(shè)計(jì)利用固體平板培養(yǎng)基測定酵母菌在不同溫度和不同 pH 值條件下的生長狀況，得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)為發(fā)酵床研究奠定了良好的基礎(chǔ) 。

3.2 生態(tài)養(yǎng)殖床前景探討

生態(tài)養(yǎng)殖床的養(yǎng)豬模式，因豬糞便被有機(jī)墊料消化分解，從而沒有廢棄物排出養(yǎng)豬場，減輕了對環(huán)境的污染，并且節(jié)約了清潔用水，豬在生態(tài)養(yǎng)殖床墊料上采食菌體蛋白，抗病能力明顯增強(qiáng)了。生態(tài)養(yǎng)殖床中的微生物活動非常的活躍，伴隨著熱量的大量排放，在冬季低溫時節(jié)，生態(tài)養(yǎng)殖床表面的溫度可以達(dá)到 25 ℃，并且因其質(zhì)地松軟，成為豬喜愛活動和休息的場所，但是如果到高溫季節(jié)時，生態(tài)養(yǎng)殖床設(shè)計(jì)不當(dāng)則會造成溫度過高而影響豬生長，所以生態(tài)養(yǎng)殖床的設(shè)計(jì)是十分重要的。生態(tài)養(yǎng)殖床的墊料除了要防止水分過大外，同時還需防止墊料過干而起塵，這個需要以豬走動不起塵土為準(zhǔn)，生態(tài)養(yǎng)殖床舍還要注意通風(fēng)，屋頂不低于 3.5 m，并且窗戶齊全，還需要有隔熱保溫層。豬生態(tài)養(yǎng)殖床養(yǎng)殖是一種新的飼養(yǎng)模式，在生產(chǎn)管理中隨時都會出現(xiàn)新的問題，管理者必須及時發(fā)現(xiàn)問題、解決問題，才能更好地利用微生態(tài)養(yǎng)殖，獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益。