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豆粕在畜禽飼料中應(yīng)用十分廣泛，但豆粕含有胰蛋白酶抑制因子、大豆抗原蛋白及寡糖等抗營養(yǎng)因子，限制了其在幼齡動物中的使用。微生物發(fā)酵可以將豆粕中大分子抗原蛋白降解為容易被幼齡動物消化吸收的小分子蛋白，將不能消化吸收的植酸磷降解為無機磷，同時產(chǎn)生益生素、乳酸及未知生長因子等，從而提高豆粕的營養(yǎng)價值。酶解也是改善豆粕蛋白質(zhì)特性的一種很好的方法，大豆蛋白酶解物具有比大豆蛋白更豐富的加工特性、營養(yǎng)特性和生理功能。單純發(fā)酵耗時長、損耗大、效率低，單純酶解工藝雖然耗時短、損耗小、效率高，但是雜菌增殖難以控制，在酶解過程中加入益生菌發(fā)酵可以有效地抑制大腸桿菌等雜菌的增殖。豆粕經(jīng)酶解發(fā)酵后可產(chǎn)生大量活性益生菌、乳酸、小肽和游離氨基酸等，添加到幼齡動物全價配合飼料中可以替代促生長性抗生素。本試驗將木瓜蛋白酶和植物乳桿菌共同作用于豆粕進(jìn)行酶解和發(fā)酵，旨在研究豆粕酶解發(fā)酵物對仔豬的生長性能、血清指標(biāo)及腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，為家畜無抗飼料健康養(yǎng)殖提供有益參考。

1.1 酶解發(fā)酵豆粕的制備

參考魏金濤等的方法，在塑料桶中加入10ｋｇ粒徑12目的豆粕，按300U/ｇ 添加木瓜蛋白酶、2×10⁷ CFU/ｇ 接種植物乳桿菌之后加入37℃溫水30ｋｇ，攪拌均勻后置于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中酶解發(fā)酵24ｈ，所得豆粕酶解發(fā)酵物用于配制飼糧。飼喂用的豆粕酶解發(fā)酵物均在配料前1天的07：00和15：00各制備1次。

1.2 試驗動物與飼養(yǎng)管理

1.2.1 試驗動物與試驗設(shè)計

采用單因子完全隨機試驗設(shè)計，按照品種、胎次基本一致的原則，將144 頭9日齡健康的“杜×長×大”三元雜交育肥仔豬隨機分為３ 組，每組６個重復(fù)，每個重復(fù)８ 頭豬（公母各占1/2）。陰性對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，抗生素對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧＋60ｇ/ｔ 吉他霉素，試驗組飼喂試驗飼糧（基礎(chǔ)飼糧中10％豆粕被豆粕酶解發(fā)酵物替代）。預(yù)試期7ｄ，正試期42ｄ。

1.2.2 飼養(yǎng)管理

試驗場地采用漏縫地板，豬只自由采食，自由飲水。免疫消毒程序按照豬場常規(guī)方法進(jìn)行。

1.3 試驗飼糧

飼糧參照NRC（2012） 豬的營養(yǎng)需要并結(jié)合所在豬場生產(chǎn)實際制定配方，其組成及營養(yǎng)水平見表1。陰性對照組飼糧飼喂前添加自來水做成濕拌料，精確計算水的添加量，保證飼糧中含水量為28％左右。

1.4 樣品的采集與制備

1.4.1 血液采集與血清的制備

在正試期第42天從每組選取6頭豬，抽取頸靜脈血靜置后3000r/min 離心10min，制備的血清置于-70℃ 超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 盲腸內(nèi)容物的采集

在正試期第42天從每組選取6頭豬，頸部放血致死，無菌條件下取十二指腸、盲腸和大腸內(nèi)容物于滅菌的凍存管中，并迅速將凍存管放于充滿液氮的液氮罐中，備測。

1.5 測定指標(biāo)與方法

1.5.1 試驗儀器

AUY-220型電子分析天平，日本島津UV-2550型紫外可見分光光度計，德國福斯FOSS-2300型全自動凱氏定氮儀，羅氏MODULP-800全自動生化分析儀，EDC-810PCR擴(kuò)增儀，JY300水平電泳儀，JY-02S 紫外分析儀。

1.5.2 營養(yǎng)成分的測定

粗蛋白質(zhì)含量測定按照GB/T6432-1994《飼料中粗蛋白測定方法》進(jìn)行；小肽含量測定按照GB/T22492-2008《大豆肽粉》方法進(jìn)行；水溶性蛋白含量測定按照NY/T1205-2006《大豆水溶性蛋白含量的測定》方法進(jìn)行；乳酸桿菌數(shù)量的測定采用MRS 瓊脂培養(yǎng)基計數(shù)。

1.5.3 生長性能的測定

分別在試驗開始與試驗結(jié)束時，以個體為單位對所有試驗豬進(jìn)行空腹稱重；試驗過程中詳細(xì)觀察與記錄仔豬健康和生長狀況、采食量、腹瀉等情況。計算平均日增重、平均日采食量、料重比和腹瀉率等。

1.5.4 血清指標(biāo)的測定

血清生化指標(biāo)的測定采用羅氏MODULP-800全自動生化分析儀測定。

血清中總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量等測定采用試劑盒法，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.5.5 腸道菌群結(jié)構(gòu)的測定

采用實時熒光定量PCR方法測定腸道中總細(xì)菌數(shù)、乳酸桿菌數(shù)和大腸桿菌數(shù)。引物序列及參數(shù)見表2，引物由上海生工生物工程有限公司合成。按照北京天根基因組DNA提取試劑盒說明書提取腸內(nèi)容物DNA，通過將含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠進(jìn)行回收，純化分別獲得總細(xì)菌、乳酸桿菌和大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)品，然后將細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，以不同標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以實時熒光定量PCR反應(yīng)過程中出現(xiàn)熒光信號的初始循環(huán)數(shù)（Ct）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時，將待測樣品進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)得到樣品的Ct值，并將其和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，獲得各個樣品中細(xì)菌數(shù)量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），不同組間的平均值差異用Student-Newman-Keuls（S-N-K） 比較 。數(shù)據(jù)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P＜0.05 表示差異顯著。

2.1 豆粕酶解發(fā)酵前后營養(yǎng)成分變化

從表３ 可知，豆粕酶解發(fā)酵前后總能及粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣和總磷含量差異不顯著（P＞0.05）；但是豆粕酶解發(fā)酵物中的小肽和水溶性蛋白含量比豆粕分別提高了3.56倍和4.76倍（P＜0.05），乳酸桿菌數(shù)量達(dá)到6.14×10⁹CFU/ｇ。

2.2 豆粕酶解發(fā)酵物對仔豬生長性能的影響

從表4可知，試驗組仔豬的末重、平均日增重、平均日采食量分別比陰性對照組提高5.06％、10.07％、5.03％（P＜0.05），腹瀉率比陰性對照組降低39.59％（P＜0.05）；試驗組與抗生素對照組相比各指標(biāo)差異均不顯著（P ＞0.05），但是平均日增重和平均日采食量都有高于抗生素對照組的趨勢。

2.3 豆粕酶解發(fā)酵物對仔豬血清指標(biāo)的影響

從表５ 可知，試驗組仔豬的堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性均顯著高于陰性對照組（P ＜0.05），其他指標(biāo)差異不顯著（P ＞0.05）；試驗組和抗生素對照組仔豬血清生化指標(biāo)差異不顯著（P＞0.05）。

從表6可知，試驗組仔豬血清T-AOC、SOD 活性、MDA 含量與陰性對照組相比均有顯著改善（P＜0.05），與抗生素對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 豆粕酶解發(fā)酵物對仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

從表７ 可知，試驗組仔豬盲腸、大腸中乳酸桿菌數(shù)量顯著高于陰性對照組和抗生素對照組（P＜0.05）；豆粕酶解發(fā)酵物使腸道各部位食糜中乳酸桿菌數(shù)量大幅度提高，且隨著腸段后移，乳酸桿菌數(shù)量增加幅度越大；試驗組仔豬腸道中盲腸、大腸中的大腸桿菌數(shù)量有低于抗生素對照組和陰性對照組的趨勢（P＞0.05）。試驗組十二指腸中總細(xì)菌數(shù)比陰性對照組和抗生素對照組低（P ＜0.05），各組間盲腸、大腸中總細(xì)菌數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。

3.1 豆粕酶解發(fā)酵物對仔豬生長性能的影響

潘翠玲等發(fā)現(xiàn)大豆蛋白酶解物能克服早期斷乳應(yīng)激引起的仔豬食欲下降、腹瀉和生長遲滯等不良現(xiàn)象。付曉等報道酶解豆粕組仔豬粗蛋白質(zhì)、鈣和磷消化率均高于對照組。這都說明了豆粕酶解后更容易被仔豬消化吸收。詹湉湉等報道豆粕合理的發(fā)酵時間為72ｈ，料水比為1∶0.7，寡肽和游離氨基酸含量可達(dá)2.48％。胡瑞等將豆粕液態(tài)發(fā)酵最佳發(fā)酵時間為48ｈ，但是加入蛋白酶后發(fā)酵豆粕游離氨基酸含量提高了0.36％，大分子蛋白質(zhì)降解程度顯著升高。本研究利用木瓜蛋白酶和植物乳桿菌在液態(tài)酶解發(fā)酵豆粕24ｈ后小肽含量達(dá)到了9.63％，飼養(yǎng)試驗結(jié)果表明試驗組仔豬的末重、平均日增重、平均日采食量略優(yōu)于抗生素對照組， 和陰性對照組相比提高了5.06％、10.07％、5.03％。這主要是由于豆粕酶解發(fā)酵后大分子蛋白被分解，提高了部分氨基酸含量，部分抗?fàn)I養(yǎng)因子被降解，而且豆粕在液態(tài)下經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后產(chǎn)生大量乳酸等，使得所配制飼料具有酸香味，刺激動物食欲。本文中試驗組仔豬腹瀉率比陰性對照組低39.59％，與抗生素對照組差異不顯著，據(jù)呂剛等報道酶解豆粕濕喂仔豬組全期料重比、腹瀉指數(shù)優(yōu)于干燥酶解豆粕組。本試驗結(jié)果說明了豆粕酶解發(fā)酵后不經(jīng)干燥直接配制飼糧，提高了飼糧適口性，有益于動物生長性能的提高，可以實現(xiàn)仔豬飼料中不添加促生長性抗生素。但是中國南方高溫季節(jié)采用濕的豆粕酶解發(fā)酵物一定要防止原料久置變質(zhì)。

3.2 豆粕酶解發(fā)酵物對仔豬血清指標(biāo)的影響

血清堿性磷酸酶活性高低可以反映動物的生長速度和生長性能。本試驗中試驗組仔豬的堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性均顯著高于陰性對照組，說明豆粕酶解發(fā)酵物可以促進(jìn)仔豬蛋白質(zhì)吸收，提高鈣磷利用率，這與生長性能的表現(xiàn)呈一致性。機體內(nèi)存在的各種抗氧化酶能夠互相合作共同構(gòu)成機體對自由基的第一道防線。血清MDA含量的高低間接反映機體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。本試驗中試驗組仔豬血清T-AOC、SOD活性顯著高于陰性對照組，MDA含量顯著低于陰性對照組，說明豆粕酶解發(fā)酵物提高了仔豬機體抗氧化能力，減少自由基對機體的傷害。

3.3 豆粕酶解發(fā)酵物對仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

健康仔豬腸道中多種細(xì)菌數(shù)量都隨腸段后移而逐漸增加。乳酸桿菌是豬腸道正常菌群中的重要優(yōu)勢菌。若仔豬發(fā)生腹瀉，仔豬腸道內(nèi)優(yōu)勢菌群數(shù)量會發(fā)生改變，如乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量會降低，大腸桿菌的數(shù)量增加。本研究中試驗組仔豬盲腸、大腸段乳酸桿菌數(shù)量顯著高于陰性對照組和抗生素對照組；豆粕酶解發(fā)酵物使腸道各部位食糜中乳酸桿菌數(shù)量大幅度提高，且隨著腸段后移，乳酸桿菌數(shù)量增加幅度越大。試驗組十二指腸中總細(xì)菌數(shù)比陰性對照組和抗生素對照組低，且十二指腸段總細(xì)菌數(shù)低于盲腸、大腸。這主要是由于十二指腸細(xì)菌的種類及數(shù)量極少，胃酸、膽汁作用及小腸液流量大，蠕動節(jié)奏快，細(xì)菌在繁殖前即被沖洗到遠(yuǎn)端回腸及結(jié)腸。試驗組仔豬腸道中乳酸桿菌為優(yōu)勢菌群，擠占了大腸桿菌的生存空間，使得大腸桿菌數(shù)量下降，試驗豬只腹瀉率降低。本試驗中抗生素選用的為目前在家禽和豬飼料中廣泛使用的吉他霉素，吉他霉素可以使豬腸道中大腸桿菌數(shù)量顯著減少，對乳酸桿菌數(shù)量卻沒有顯著影響。仔豬腸道菌群由乳酸桿菌、雙歧桿菌、小梭菌等厭氧菌以及腸桿菌、腸球菌等需氧菌組成，后期研究中筆者將對仔豬腸道中的雙歧桿菌、腸球菌等進(jìn)行分析定量，更為全面地了解豆粕酶解發(fā)酵物對仔豬腸道中菌群結(jié)構(gòu)的影響。

豆粕酶解發(fā)酵物能促進(jìn)仔豬生長發(fā)育，提高生長性能，增強機體抗氧化能力，利于乳酸桿菌在腸道內(nèi)形成優(yōu)勢菌群。