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乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一類(lèi)革蘭氏染色呈陽(yáng)性，發(fā)酵碳水化合物以乳酸為主要代謝終產(chǎn)物的兼性厭氧細(xì)菌的總稱(chēng)，共包含有乳桿菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬、腸球菌屬等43個(gè)屬，這些屬又可劃分為373個(gè)種和亞種。乳酸菌發(fā)酵歷史悠久，廣泛應(yīng)用于乳制品、肉制品、青貯飼料、谷物和果蔬等的生產(chǎn)加工中，在人類(lèi)生產(chǎn)、生活中發(fā)揮著重要作用，是食品工業(yè)中重要的微生物。目前，已發(fā)現(xiàn)乳酸菌可以棲居于人和動(dòng)物腸道及其他器官中，尤其是益生乳酸菌能夠調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，具有抗腫瘤、降膽固醇、降血壓、延緩衰老等功效^[1]。

隨著分子生物學(xué)理論和生物技術(shù)的發(fā)展，大量基因組的完成以及功能基因的不斷破譯為乳酸菌的深層次研究提供了新基礎(chǔ)，研究人員不斷開(kāi)發(fā)新的分子生物學(xué)方法和手段對(duì)乳酸菌分類(lèi)鑒定、基因功能及其系統(tǒng)發(fā)育和種群進(jìn)化進(jìn)行分析研究。乳酸菌微進(jìn)化研究是從分子水平上了解乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系并重塑其進(jìn)化歷程，為揭示其生物學(xué)功能的形成和進(jìn)化機(jī)制提供遺傳學(xué)基礎(chǔ)，有利于將其更好的應(yīng)用于食品工業(yè)中。

生物進(jìn)化的研究體現(xiàn)在兩個(gè)層次上：宏進(jìn)化(macroevolution)和微進(jìn)化(microevolution)。微進(jìn)化，也稱(chēng)“種內(nèi)進(jìn)化”，指的是同一生物種內(nèi)或近緣物種之間的進(jìn)化，是一個(gè)導(dǎo)致種內(nèi)分化的過(guò)程，著重于研究基因?qū)π誀畹挠绊懸约斑x擇壓力對(duì)基因變異的作用^[2]。微進(jìn)化中基因的遺傳變異通常具有可明確闡述的分子與遺傳基礎(chǔ)，可以追溯其發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，有規(guī)律可循，因此是生物學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)之一。

現(xiàn)代達(dá)爾文主義理論將生物的進(jìn)化定義為群體內(nèi)基因頻率的改變，因此，從分子水平上來(lái)說(shuō)，對(duì)進(jìn)化的研究，即對(duì)微進(jìn)化的研究，就是對(duì)某一群體的等位基因頻率的動(dòng)態(tài)變化的研究^[3]。微進(jìn)化的動(dòng)力包括：基因突變、基因重組、遺傳漂變和自然選擇^[2]。基因突變包括核苷酸的替代、插入/缺失、重組和基因轉(zhuǎn)換，是進(jìn)化的絕對(duì)動(dòng)力；基因重組在一定程度上可以增加遺傳變化，但不會(huì)改變等位基因頻率；遺傳漂變對(duì)中性突變的突變子的固定方面發(fā)揮著重要作用，尤其在小群體中；自然選擇是指自然環(huán)境對(duì)基因變異的選擇作用，正向選擇淘汰群體中的變異，而平衡的選擇增加其變異^[4]。

遺傳變異的穩(wěn)定遺傳是細(xì)菌最終適應(yīng)新環(huán)境的基礎(chǔ)。目前發(fā)現(xiàn)的乳酸菌的遺傳變異機(jī)制有兩大類(lèi)：一類(lèi)是基因水平轉(zhuǎn)移(Horizontal Gene Transfer，HGT)，乳酸菌基因組中基因水平轉(zhuǎn)移(HGT)是個(gè)普遍的進(jìn)化事件^[5]。大量證據(jù)顯示乳酸菌為了快速適應(yīng)新環(huán)境，可通過(guò)HGT從環(huán)境中獲得一段遺傳物質(zhì)以期適應(yīng)新環(huán)境而生存^[6, 7]。另一方面，乳酸菌在微進(jìn)化中不斷獲得新基因片段的同時(shí)，還具有將“無(wú)用”基因片段不斷鈍化、缺失的能力，以維持其遺傳物質(zhì)的相對(duì)平衡。2006年，Makarova等^[8]對(duì)9株乳酸菌基因組分析發(fā)現(xiàn)，在營(yíng)養(yǎng)豐富的環(huán)境中，合成途徑中相關(guān)酶類(lèi)有不同程度的缺失，這種突變不斷積累，最終形成了不同的營(yíng)養(yǎng)缺陷型乳酸菌菌株。這種基因鈍化、缺失的現(xiàn)象不僅出現(xiàn)在德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、格氏乳桿菌(Lactobacilus gasseri)和約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)亞群中，也頻繁出現(xiàn)在基因組容量較大的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)和植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)中^[5]。

另一類(lèi)就是其自身基因的變異，包括點(diǎn)突變(不導(dǎo)致編碼氨基酸變異的同義突變或?qū)е戮幋a氨基酸變異的非同義突變)、基因重組、短重復(fù)序列變異等^[2]。通過(guò)非同義突變率(d_N或K_A)和同義突變率(d_S或K_S)的比值可判定一個(gè)突變位點(diǎn)的選擇壓力(d_N/d_S<1.0表示負(fù)向選擇；d_N/d_S=1.0為中性進(jìn)化；d_N/d_S>1.0為正向自然選擇)^[9, 10]。2012年，Bachmann等^[11]對(duì)3株乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示3株菌在乳中連續(xù)培養(yǎng)1000代后，其基因組中分別發(fā)生了4、6和21處點(diǎn)突變，包括編碼氨基酸合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和DNA錯(cuò)配修復(fù)mutL基因等出現(xiàn)了SNP突變，其d_N/d_S值均大于1，顯示出菌株為適應(yīng)新環(huán)境正經(jīng)歷著正向選擇壓力，基因組的變異是菌株為了適應(yīng)從植物體到乳的生境過(guò)渡而經(jīng)歷的進(jìn)化過(guò)程。

乳酸菌為原核生物，其微進(jìn)化的研究，只能借助于保守序列的比較研究，通過(guò)高分辨率的標(biāo)志區(qū)分不同菌株的種群結(jié)構(gòu)，再根據(jù)這些變異的種群分布揭示細(xì)菌可能的微進(jìn)化歷程，為了揭示未知的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)變異，科學(xué)家們已經(jīng)發(fā)展了很多DNA指紋分析技術(shù)和基于核酸序列的分析手段。

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，大量分子分型技術(shù)和方法被引入到乳酸菌的分型研究中，比如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA技術(shù)(Randomly Amplified Polymorphic DNA，RAPD)^[12]、變性梯度凝膠電泳標(biāo)記技術(shù)(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)^[13]、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)^[14]、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)^[15]以及脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)(Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE)^[16, 17]等技術(shù)，都是基于電泳技術(shù)，以不同菌株基因組DNA圖譜的差異為依據(jù)進(jìn)行乳酸菌的分型研究。但是，這些技術(shù)分辨率較低、重現(xiàn)性低，在親緣關(guān)系較近菌種的鑒定中實(shí)用性越來(lái)越少，并且僅局限于實(shí)驗(yàn)室的條件下，不能夠?qū)崿F(xiàn)數(shù)據(jù)的交流和比較。因此對(duì)于近緣菌種的分析，需要一個(gè)更方便可靠且分辨率更高的方法。

為了進(jìn)一步深入研究細(xì)菌的基因型以及微進(jìn)化，出現(xiàn)了一系列基于DNA序列差異的分析技術(shù)與方法。早期的有基于單個(gè)基因的16S rRNA基因間隔區(qū)(Intergenic Spacer Region，ISR)^[18]、重復(fù)基因外回文序列分析技術(shù)(Repetitive Extragenic Palindromic Sequences，Rep-PCR)等；隨后，基于多個(gè)看家基因部分片段的核苷酸序列分析被用于乳酸菌的基因分型研究^[19]，如多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析技術(shù)(Multiple-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis，MLVA)^[20]、多位點(diǎn)序列分型技術(shù)(Multi-locus Sequence Typing，MLST)^[16, 21]等。其中MLST一度成為最成熟和最具標(biāo)準(zhǔn)化的分析手段，因其簡(jiǎn)便快速、重復(fù)性強(qiáng)和分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于乳酸菌遺傳多樣性、種群結(jié)構(gòu)及微進(jìn)化的研究中。

2004年，de Las Rivas等^[22]首次利用MLST技術(shù)對(duì)18株分離自酒類(lèi)酒球菌(Oenococcus oeni)的5個(gè)管家基因進(jìn)行了多位點(diǎn)序列分型，研究顯示重組是Oenococcus oeni菌株遺傳多樣性增加的主要原因。2007年，Cai等^[23]采用6個(gè)等位基因的MLST技術(shù)分析了40株分離自植物、人腸道、人血液以及不同地區(qū)干酪中L. casei，結(jié)果表明分離自不同環(huán)境中的菌株由于特定的環(huán)境使其發(fā)生了特定的遺傳進(jìn)化，其遺傳特性與分離環(huán)境相關(guān)，并提出乳酸菌在不同自然環(huán)境選擇的作用下經(jīng)歷的進(jìn)化過(guò)程是可追溯的。2011年，為了驗(yàn)證嬰兒腸道中Bifidobacterium longum subsp. longum是否來(lái)源于母親,Makino等^[24]采用MLST技術(shù)研究了8對(duì)母親和嬰兒腸道的207株Bifidobacterium longumsubsp. longum。研究發(fā)現(xiàn)分離株的聚類(lèi)大都以不同的家庭為單位，表明該菌株可能由母親傳遞給嬰兒。2013年，Dan等采用MLST技術(shù)對(duì)分離自中國(guó)和蒙古國(guó)的自然發(fā)酵乳制品中的50株乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)進(jìn)行了種群結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明Leuconostoc lactis存在種內(nèi)重組現(xiàn)象，但其明顯地形成了高度克隆的兩個(gè)亞群^[25]。

越來(lái)越多的研究表明，在遺傳多樣性分析方面，MLST是行之有效的技術(shù)手段^[26]。研究人員不斷利用MLST技術(shù)鑒定得到許多新的物種，如L. delbrueckii subsp. sunkii 和L. delbrueckii subsp. jakobsenii的發(fā)現(xiàn)^[27, 28]。在種群結(jié)構(gòu)和微進(jìn)化分析方面，MLST也顯示出來(lái)較大的潛力，可檢測(cè)種群內(nèi)頻繁的重組現(xiàn)象，追溯不同生境下各種群結(jié)構(gòu)的進(jìn)化歷程，但遺憾的是，相較于全基因組來(lái)說(shuō)，MLST位點(diǎn)所攜帶的遺傳信息十分有限，其揭示的遺傳進(jìn)化關(guān)系大都局限于籠統(tǒng)的種群結(jié)構(gòu)分群信息，給微進(jìn)化的分析帶來(lái)一定難度。

近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷出現(xiàn)，基于全基因組范圍內(nèi)DNA序列差異分析的全基因組測(cè)序技術(shù)(Whole-genome sequencing)不斷用于細(xì)菌群體遺傳學(xué)和微進(jìn)化的研究^[29]，以其低成本、高通量和耗時(shí)短等特點(diǎn)為乳酸菌微進(jìn)化、代謝多樣性及其功能基因的研究注入了強(qiáng)勁的驅(qū)動(dòng)力。

基因組重測(cè)序技術(shù)(Whole-genome re-sequencing)是指對(duì)已知基因組序列的物種進(jìn)行不同個(gè)體的基因組測(cè)序，在此基礎(chǔ)上檢測(cè)個(gè)體或群體的基因差異或結(jié)構(gòu)差異，進(jìn)而進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析^[30]。其原理是將重測(cè)序結(jié)果與已知序列比對(duì)，尋找單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)、插入缺失位點(diǎn)(Insertion/Deletion，InDel)、結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)(Structure Variation，SV)及拷貝數(shù)變化(Copy Number Variations，CNV)，發(fā)現(xiàn)大量基因差異，實(shí)現(xiàn)遺傳進(jìn)化分析及重要性狀候選基因的預(yù)測(cè)。

2001年完成的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403)全基因組測(cè)序是乳酸菌的破冰之作，隨后進(jìn)入乳酸菌基因組測(cè)序的高峰階段，我國(guó)也于2008年完成第一株L. casei Zhang的全基因組測(cè)序^[31]。到目前為止，已有80%以上的乳酸菌種完成了全基因組序列測(cè)定，陸續(xù)破譯的乳酸菌基因組不僅解析了相應(yīng)的生物代謝途徑，同時(shí)為從全基因組水平分析乳酸菌的進(jìn)化歷程提供了參考序列。

2009年，Cai等^[32]以L. casei ATCC 334基因組序列為參考菌株，對(duì)21株分離自植物、人體以及不同地區(qū)干酪中的L. casei進(jìn)行了全基因組微陣列的比較基因組雜交分析(comparative genome hybridization,CGH)，結(jié)果顯示與參考菌株相比，分離自不同環(huán)境中的L. casei菌株具有各自獨(dú)特的功能基因，說(shuō)明這些菌株在適應(yīng)不同環(huán)境的同時(shí)，基因發(fā)生不同程度的插入或缺失，這與Cai等2007年采用MLST技術(shù)分析所得結(jié)果一致，不僅驗(yàn)證了MLST方案的準(zhǔn)確性，也說(shuō)明基因組重測(cè)序技術(shù)是研究乳酸菌微進(jìn)化的行之有效的技術(shù)手段。

近年來(lái)，隨著基因組測(cè)序技術(shù)不斷更新，測(cè)序通量顯著遞增，測(cè)序成本銳減，使得大批量、大規(guī)模測(cè)定乳酸菌的某一類(lèi)群成為可能，越來(lái)越多的學(xué)者嘗試著從全基因組角度解析乳酸菌的群體遺傳與物種分化過(guò)程。2013年，Smokvina等以L. casei Zhang、ATCC334、BL23為參照序列，采用基因組測(cè)序技術(shù)完成了34株L. casei分離株的基因組重測(cè)序，系統(tǒng)分析了L. casei不同菌株糖代謝能力的差異^[33]。結(jié)果顯示，L. casei包含多個(gè)磷酸烯醇式丙酮酸運(yùn)輸系統(tǒng)(Phosphoenolpyruvate Transport System，PTS)，相對(duì)于L. johnsonii和L. acidophilus多出10-20個(gè)完整的PTS系統(tǒng)，使得這些菌株可利用更多種類(lèi)的糖，指示出該菌可適應(yīng)更多的生境。進(jìn)一步分析乳源L. casei分離株編碼的PTS系統(tǒng)相對(duì)較少，推測(cè)可能是適應(yīng)了乳中營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，鈍化、丟棄了長(zhǎng)期不使用的部分轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。同時(shí)，Toh等^[34]通過(guò)對(duì)L. casei、L. paracasei和L. rhamnosus基因組比較分析時(shí)也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的現(xiàn)象，這些充分說(shuō)明了L. casei為適應(yīng)不同環(huán)境而發(fā)生了定向的微進(jìn)化歷程。

2014年，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)的孫志宏^[35]采用基因組重測(cè)序技術(shù)完成了146株Lactobacillus模式菌株基因組的測(cè)定，結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫(kù)中已完成的3株Lactobacillus模式菌株的全基因組序列，站在全基因組的角度對(duì)整個(gè)乳桿菌屬各種系的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了詮釋。該研究建立了含有72個(gè)基因的Lactobacillus核心基因集，深入解析了149株Lactobacillus模式菌株的種系發(fā)育情況和物種分化歷程，結(jié)果表明Lactobacillus基因組遺傳多樣性遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)細(xì)菌分類(lèi)學(xué)定義中的“科”，而且以72個(gè)核心基因?yàn)橐罁?jù)可將乳桿菌模式菌株分為2個(gè)大的進(jìn)化分支：Oenococcus、Pediococcus、Weissella、Leuconostoc和Lactobacillus屬于一個(gè)進(jìn)化分支Lactobacillus complex，而屬于同一祖先分化的Lactococcus、Streptococcus和Enterococcus處于Lactobacillus complex分化前的另一個(gè)分支。

對(duì)于每個(gè)生物體來(lái)說(shuō)，基因組包含了整個(gè)生物體的遺傳信息。上述研究結(jié)果均表明，全基因組測(cè)序技術(shù)能夠完整地反映基因組DNA上的遺傳信息，進(jìn)而比較全面地揭示基因組的復(fù)雜性和多樣性，成為研究乳酸菌微進(jìn)化的強(qiáng)有力的技術(shù)手段。

細(xì)菌微進(jìn)化研究反應(yīng)了環(huán)境對(duì)種群進(jìn)化的塑造和影響。乳酸菌是重要的食品工業(yè)微生物，其遺傳背景和進(jìn)化歷程是研究、開(kāi)發(fā)乳酸菌的首要基礎(chǔ)。研究乳酸菌的微進(jìn)化機(jī)制，首先可以對(duì)乳酸菌進(jìn)行進(jìn)化溯源，這有利于闡明乳酸菌各種屬間的親緣及進(jìn)化關(guān)系，重建乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，從而為建立針對(duì)乳酸菌的更精確、快速的分類(lèi)鑒定體系提供理論依據(jù)。其次，隨著益生菌概念的提出，乳酸菌的益生特性不斷被驗(yàn)證，但仍有許多未知的功能尚未被發(fā)現(xiàn)，研究乳酸菌的微進(jìn)化機(jī)制，可以從分子水平上解析其生物學(xué)功能的形成和進(jìn)化機(jī)制，找到益生特性的關(guān)鍵基因，進(jìn)而針對(duì)相關(guān)基因開(kāi)展基礎(chǔ)研究，并拓寬乳酸菌的應(yīng)用范圍，這有利于深入發(fā)掘國(guó)內(nèi)豐富的乳酸菌資源。同時(shí)，在乳酸菌的抑菌性及工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)酵特性等方面的研究中，乳酸菌的微進(jìn)化研究也可以為發(fā)酵劑菌株篩選與制備提供強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)，篩選出具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良菌種，并使其更好的應(yīng)用于食品工業(yè)。這些均對(duì)我國(guó)食品工業(yè)的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展有著相當(dāng)重要的戰(zhàn)略意義。此外，乳酸菌微進(jìn)化作為生物進(jìn)化的一部分，其研究可以極大的豐富現(xiàn)代進(jìn)化理論，還可以從基因突變率等方面對(duì)傳統(tǒng)的進(jìn)化模型如分子鐘^[4]等進(jìn)行驗(yàn)證。

縱觀現(xiàn)有的微進(jìn)化研究方法，僅以單個(gè)基因?yàn)檠芯繉?duì)象的16S rRNA基因序列同源性研究，并不能真實(shí)的反映乳酸菌在自然界各種生境中的進(jìn)化關(guān)系，而基于多個(gè)管家基因位點(diǎn)的核酸序列分析方法，如MLST技術(shù)，雖然具有分辨率高、數(shù)據(jù)可靠、重復(fù)性好，不同實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)便于比較，有利于全球范圍內(nèi)菌株間的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化等諸多優(yōu)點(diǎn)，但此類(lèi)方法畢竟只局限于整體基因組上的個(gè)別位點(diǎn)，這很有可能漏掉十分關(guān)鍵的遺傳信息，導(dǎo)致分析所構(gòu)建的種群結(jié)構(gòu)與真實(shí)的存在過(guò)多偏差。最近幾年高通量測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，使大規(guī)模測(cè)定細(xì)菌全基因組序列成為可能，研究學(xué)者可綜合利用群體遺傳學(xué)、微生物學(xué)、生物信息學(xué)等方法，對(duì)完整的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行深度挖掘，全面、系統(tǒng)地了解乳酸菌基因組的結(jié)構(gòu)和組成，從而為乳酸菌微進(jìn)化機(jī)制的研究開(kāi)辟新思路。