固態(tài)發(fā)酵木薯酒精渣生產(chǎn)生物飼料的研究
木薯酒精渣是全木薯發(fā)酵制取酒精后的副產(chǎn)物, 水分含量高達(dá)85%而且酸度大, 并含大量粗纖維和粗灰分, 無法在常溫下保存, 極易腐敗變質(zhì)造成環(huán)境污染, 即使作為飼料進(jìn)行飼喂, 適口性比較差, 動(dòng)物難以消化吸收, 成為木薯全渣發(fā)酵酒精的主要固廢物, 是生產(chǎn)企業(yè)無法處理的固廢污染難題。以木薯酒精渣為主要原料進(jìn)行發(fā)酵飼料研制, 人為控制的條件下, 以工業(yè)副產(chǎn)物木薯渣為主要原料, 以玉米淀粉渣、玉米皮、濕法糖渣等工業(yè)副產(chǎn)品作為碳源和氮源的補(bǔ)充料, 添加碳酸鈣等作為緩沖劑, 通過枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌等微生物自身的生長代謝作用, 改變木薯渣的物理、化學(xué)性質(zhì)。具體就是分解部分粗纖維、粗蛋白等大分子物質(zhì), 生成單糖、雙糖、氨基酸等小分子物質(zhì), 不僅提高了飼料的消化吸收率, 而且起到深度生化加工作用。微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生并積累大量營養(yǎng)豐富的微生物菌體蛋白及其它有用的代謝產(chǎn)物, 如有機(jī)酸、醇、酯、維生素、微量元素等, 使飼料變軟變香, 增加營養(yǎng), 最終形成適口性好、營養(yǎng)豐富、活菌含量高的生物飼料。湯小朋等研究黑曲霉固態(tài)發(fā)酵對木薯渣品質(zhì)的影響, 最優(yōu)條件發(fā)酵后結(jié)果表明:與對照組相比, 以干物質(zhì)為基礎(chǔ), 粗纖維含量由22.26%降低到17.71%, 還原糖含量由1.42%提高到5.11%, 粗蛋白質(zhì)含量由8.67%提高到13.48%, 粗脂肪含量由7.89%提高到11.72%, 粗灰分含量由6.02%提高到7.31%, 顯著提高木薯渣的營養(yǎng)價(jià)值。畜禽日糧中添加木薯渣的研究很多, 蔣建生等研究表明, 在肉鴨育雛期 (1~14日齡) 添加1%發(fā)酵木薯渣飼料替代全價(jià)飼料有利于促進(jìn)雛鴨飼料轉(zhuǎn)化。潘慧華等研究結(jié)果表明, 在肉用鴨的0~2周齡、3~4周齡和5~7周齡日糧中分別添加2%、4%和8%的木薯渣用來替代三七糠既能滿足肉鴨對粗纖維的需求, 同時(shí)降低飼料的成本。于向春等用不同復(fù)合菌劑發(fā)酵木薯渣, 以不同的比例進(jìn)行混合替代文昌雞飼料, 結(jié)果對文昌雞的生長影響不大, 所以發(fā)酵木薯渣可替代部分文昌雞飼料以降低成本。張偉濤等將不同發(fā)酵方式處理后的木薯渣添加到羅非魚的飼料中, 既能被魚體充分吸收利用, 又能滿足羅非魚正常的營養(yǎng)需求。蔡永權(quán)等研究表明, 以青貯木薯渣為主料, 搭配2 kg精料添加, 18~25月齡肉牛平均日增重達(dá)到0.591kg, 飼養(yǎng)成本被降低, 質(zhì)量增速較快, 可以獲得不錯(cuò)的經(jīng)濟(jì)效益。
1.1 試驗(yàn)菌種 芽孢桿菌:枯草芽孢桿菌BI1、枯草芽孢桿菌B10-5;產(chǎn)乳酸菌:凝結(jié)芽孢桿菌、發(fā)酵乳桿菌, 均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。 1.2 木薯渣固體發(fā)酵飼料配方 木薯渣70%、玉米淀粉渣20%、玉米皮10%。 1.3 培養(yǎng)方法 1.3.1 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L, 酵母浸出粉5 g/L, NaCl 10 g/L, pH值7.2。 肉湯培養(yǎng)基:牛肉膏5 g/L, 蛋白胨10 g/L, NaCl5 g/L, p H值7.2~7.4。 淀粉培養(yǎng)基:牛肉膏5 g/L, 蛋白胨5 g/L, NaCl 5 g/L, 可溶性淀粉20 g/L, 瓊脂18 g/L, pH值7.2。 MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L, 牛肉膏10 g/L, 酵母浸出粉5 g/L, 葡萄糖5 g/L, CH3COONa 5 g/L, 檸檬酸二胺2 g/L, 吐溫-80 1 g/L, K2HPO4 2 g/L, MgSO4·7H2O 0.2 g/L, MnSO4·7H2O 0.05 g/L, CaCO3 20 g/L, pH值6.2。 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基:蛋白胨20 g/L, 乳糖10 g/L, 牛膽鹽5 g/L, NaCl 5 g/L, 中性紅0.03 g/L, 瓊脂18 g/L, pH值7.0。 1.3.2 芽孢桿菌種子液制備 從LB培養(yǎng)基斜面上挑取1環(huán)菌, 接入到裝有50 ml肉湯培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中, 放置于溫度37℃、轉(zhuǎn)速200 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)12 h。 1.3.3 產(chǎn)乳酸菌種子液制備 從MRS液體培養(yǎng)基中吸取1 ml培養(yǎng)液, 接入到裝有50 ml MRS液體培養(yǎng)基的250 ml廣口瓶中, 放置于溫度37℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)20 h。 1.3.4 木薯渣固態(tài)發(fā)酵飼料 將枯草芽孢桿菌BI1、枯草芽孢桿菌B10-5、凝結(jié)芽孢桿菌、發(fā)酵乳桿菌菌液按比例與一定量的水混合, 然后與木薯渣飼料混勻, 裝入發(fā)酵袋中培養(yǎng)。 1.3.5 乳酸含量的測定 準(zhǔn)確稱取發(fā)酵飼料5.00 g置于裝有50 ml蒸餾水的250 ml的三角瓶里, 充分搖勻并浸提1 h, 之后離心取上清液, 稀釋相應(yīng)倍數(shù)后用生物傳感分析儀測定其中的乳酸含量。 1.3.6 活菌數(shù)的測定 芽孢桿菌用可溶性淀粉固體培養(yǎng)基作為計(jì)數(shù)培養(yǎng)基;產(chǎn)乳酸菌用MRS固體培養(yǎng)基作為計(jì)數(shù)培養(yǎng)基;大腸桿菌用麥康凱固體培養(yǎng)基作為計(jì)數(shù)培養(yǎng)基。 1.4 發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化 1.4.1 兩株芽孢桿菌混合比例的確定 選取兩株芽孢桿菌比例為3：1、2：1、1：1、1：2、1：3這5個(gè)水平進(jìn)行分析。 1.4.2 兩株產(chǎn)乳酸菌混合比例的確定 選取兩株產(chǎn)乳酸菌比例為3：1、2：1、1：1、1：2、1：3這5個(gè)水平進(jìn)行分析。 1.4.3 芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌混合比例的確定 選取芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌比例為1：2、2：1、1：1、3：1、3：2這5個(gè)水平進(jìn)行分析。 1.4.4 總接種量的確定 選取接種量為1%、3%、5%、7%、9%這5個(gè)水平進(jìn)行分析。 1.5 發(fā)酵溫度的確定 選取溫度為22、27、32、37、42℃這5個(gè)水平進(jìn)行分析。 1.6 發(fā)酵條件的正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上, 選取影響顯著的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。采用L9 (33) 型三水平三因素正交表, 以芽孢菌與乳酸菌的接種比例、接種量、發(fā)酵溫度3個(gè)因素作為考察因素, 研究對發(fā)酵結(jié)果的影響。 1.7 育肥豬飼喂試驗(yàn) 1.7.1 試驗(yàn)動(dòng)物和分組 將120日齡60頭70 kg左右的健康的“杜×大×長”三元雜交生長肥育豬隨機(jī)分成4組, 每組3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)5頭豬。 1.7.2 試驗(yàn)日糧與設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理組, 即對照組、試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組, 分別飼喂0、5%、15%、25%不同比例木薯渣發(fā)酵飼料的基礎(chǔ)日糧 (見表1) ?；A(chǔ)日糧營養(yǎng)水平參照NRC (2012) 推薦量平衡日糧中的能量和各種營養(yǎng)物質(zhì)。1材料與方法
1.7.3 飼養(yǎng)管理
進(jìn)豬前要檢查維修圈舍設(shè)備, 并清掃圈舍, 然后用2%火堿水溶液或其它消毒藥消毒。按豬的體重、體質(zhì)強(qiáng)弱等相近的原則分4組, 每組3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)5頭。進(jìn)入豬舍后, 舍內(nèi)溫度控制在16~21℃之間, 相對濕度50%~70%之間, 保持空氣流通。自由采食, 自由飲水, 采用全自動(dòng)飲水裝置, 預(yù)試期為3 d, 正試期為30 d, 每天清掃圈舍和除糞2次, 保證豬舍內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生良好, 每周舍內(nèi)通道用2%火堿溶液或其它消毒藥消毒1次。平時(shí)經(jīng)常觀察豬群采食、排糞情況、健康狀況和精神狀態(tài), 發(fā)現(xiàn)疫病及時(shí)隔離治療。每周統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)豬采食量和增重, 及時(shí)檢測試驗(yàn)豬糞便中的微生物。
1.7.4 測定指標(biāo)
生長性能指標(biāo):分別于試驗(yàn)的開始和結(jié)束對所有試驗(yàn)豬進(jìn)行空腹稱重, 根據(jù)每個(gè)圈舍試驗(yàn)豬的總重量和頭數(shù)來計(jì)算平均頭重, 再根據(jù)平均頭重的初重和末重來計(jì)算出平均日增重。每周要記錄各組試驗(yàn)豬的采食量, 試驗(yàn)結(jié)束后結(jié)算各組試驗(yàn)豬消耗飼料的總重, 計(jì)算出平均日采食量。根據(jù)平均日增重和平均日采食量計(jì)算料重比。
糞便中微生物的測定:分別在試驗(yàn)第15 d和第30 d時(shí), 即整個(gè)試驗(yàn)時(shí)期的中期和末期, 進(jìn)行豬糞便中微生物的測定, 分別取每組試驗(yàn)豬1 h內(nèi)的新鮮豬糞, 并盡量取多只豬的糞便, 然后混勻, 準(zhǔn)確稱取糞便5 g置于裝有生理鹽水的三角瓶中, 瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠, 震蕩15 min, 使糞便中的微生物懸浮于生理鹽水中, 然后用十倍稀釋法進(jìn)行稀釋, 選取合適的稀釋梯度進(jìn)行涂布計(jì)數(shù)。乳酸菌用MRS培養(yǎng)基作為計(jì)數(shù)培養(yǎng)基, 大腸桿菌用麥康凱培養(yǎng)基作為計(jì)數(shù)培養(yǎng)基。
1.8 數(shù)據(jù)處理
采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析。
2.1 木薯渣發(fā)酵飼料兩株枯草芽孢桿菌混合比例的優(yōu)化 (見表2) 表2 兩株芽孢菌混合比例對木薯渣發(fā)酵飼料的影響 下載原表 從表2可以看出, 兩株枯草芽孢桿菌的比例對乳酸含量和活菌總數(shù)都有影響, 但影響都較小, 比例為1：2時(shí), 活菌總數(shù)有較高水平, 乳酸含量也最高, 從而確定木薯渣發(fā)酵飼料中兩株枯草芽孢桿菌BI1和B10-5的比例為1：2。2結(jié)果和分析
2.2 木薯渣發(fā)酵飼料兩株產(chǎn)乳酸菌發(fā)酵乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌混合比例的優(yōu)化 (見表3)
從表3可以看出, 兩株產(chǎn)乳酸菌的混合比例為1：2時(shí), 活菌總數(shù)最高, 但乳酸含量較低, 當(dāng)比例為1：3時(shí), 乳酸含量最高, 活菌總數(shù)也處于較高水平, 從而確定木薯渣發(fā)酵飼料中發(fā)酵乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌的比例為1：3。
2.3 木薯渣發(fā)酵飼料芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌混合比例的優(yōu)化 (見表4)
木薯渣發(fā)酵飼料中兩株枯草芽孢桿菌BI1和B10-5的比例為1：2, 發(fā)酵乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌的比例為1：3, 而芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌混合接種比例見表4。
從表4可以看出, 芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌混合比例對乳酸菌數(shù)影響相對較小, 芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌混合比例為3：2時(shí), 乳酸含量最高, 且乳酸菌數(shù)也有較高的水平, 所以確定木薯渣發(fā)酵飼料中芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌比例為3：2。
2.4 木薯渣發(fā)酵飼料總接種量的優(yōu)化
木薯渣發(fā)酵飼料中芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌比例為3：2, 總接種量見表5。
從表5可以看出, 當(dāng)接種量超過5%以后, 隨著接種量的增加, 乳酸含量增加效果并不明顯, 而且接種量太高, 在生產(chǎn)過程中發(fā)酵飼料所需要的菌液也會(huì)很高, 這樣會(huì)增加生產(chǎn)成本, 從結(jié)果可以看出, 5%的接種量各個(gè)指標(biāo)也處于較高水平, 所以最終確定接種量為5%。
2.5 木薯渣發(fā)酵飼料溫度的優(yōu)化
兩株枯草芽孢桿菌BI1和B10-5的比例為1：2, 發(fā)酵乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌的比例為1：3, 木薯渣發(fā)酵飼料中芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌比例為3：2, 總接種量5%。發(fā)酵溫度見表6。
從表6可以看出, 在22℃和27℃較低溫度木薯渣飼料不能很好地進(jìn)行發(fā)酵, 乳酸含量和產(chǎn)乳酸菌數(shù)很低, 這說明低溫使菌體的生長代謝受到抑制, 從而影響產(chǎn)酸性能。在42℃較高溫度下發(fā)酵雖然能達(dá)到一定的發(fā)酵效果, 但是溫度過高也會(huì)抑制菌株的生長, 致使乳酸菌數(shù)少于在32℃和37℃發(fā)酵的結(jié)果。從結(jié)果可以看出, 37℃下發(fā)酵效果很好, 乳酸含量和乳酸菌數(shù)都達(dá)到較好的結(jié)果。
2.6 發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)
以單因素優(yōu)化的發(fā)酵條件, 采用L9 (33) 型三水平三因素正交試驗(yàn)研究芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌的接種比例、總接種量、發(fā)酵溫度對發(fā)酵結(jié)果的影響, 結(jié)果見表7。
以乳酸含量作為指標(biāo)進(jìn)行分析, 如表8和表9所示。
表8 正交試驗(yàn)極差分析 下載原表
表9 以發(fā)酵飼料中乳酸結(jié)果進(jìn)行正交試驗(yàn)方差分析 下載原表
通過正交試驗(yàn)中各組發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸進(jìn)行分析可以看出各因素?zé)o顯著性影響, 影響因子的主次順序?yàn)?發(fā)酵溫度>接種比例>接種量, 從K值可以看出, A1B2C3發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸最多, 接種比例為3：2, 接種量為5%, 發(fā)酵溫度37℃。對A2B2C3這一組再次重復(fù)進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證, 測得發(fā)酵后乳酸含量達(dá)到2.0%。
2.7 木薯渣發(fā)酵飼料對育肥豬生長性能的影響 (見表10)
育肥豬飼喂到150日齡時(shí), 由表10可知, 對照組末重遠(yuǎn)高于試驗(yàn)Ⅲ組, 差異顯著, 略高于試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組, 試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組的末重較為一致, 也高于試驗(yàn)Ⅲ組。從平均日增重來看, 試驗(yàn)Ⅱ組添加15%木薯渣發(fā)酵飼料的結(jié)果最高。從料肉比來看, 對照組料肉比最低, 與試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組差異并不大, 但低于試驗(yàn)Ⅲ組的結(jié)果, 可見添加適量木薯渣發(fā)酵飼料的可以刺激試驗(yàn)育肥豬的采食, 但是不宜添加過量。
2.8 育肥豬糞便中微生物的測定 (見表11)
通過對各組豬糞中大腸桿菌數(shù)、乳酸菌數(shù)以及芽孢桿菌數(shù)的測定, 從表11可以看出, 試驗(yàn)Ⅱ組乳酸菌數(shù)最高, 芽孢桿菌數(shù)也有較高水平, 但四組之間沒有顯著差異。飼料經(jīng)過發(fā)酵后, 豬采食后未能改善豬腸道內(nèi)微生物環(huán)境, 也可能與飼喂時(shí)間短有關(guān)。
按最優(yōu)發(fā)酵工藝進(jìn)行發(fā)酵, 總接種量為5%, 枯草芽孢桿菌BI1與枯草芽孢桿菌B10-5接種比例為1：2, 產(chǎn)乳酸菌發(fā)酵乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌接種比例為1：3, 芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌接種比例為3：2, 發(fā)酵溫度為37℃, 發(fā)酵后木薯渣乳酸含量達(dá)到2%。添加不同比例木薯渣發(fā)酵飼料的基礎(chǔ)日糧進(jìn)行育肥豬飼喂試驗(yàn), 結(jié)果顯示飼喂添加15%木薯渣發(fā)酵飼料的基礎(chǔ)日糧的試驗(yàn)組具有較好的增重效果, 平均日增重0.78 kg, 平均日采食量2.8 kg, 料肉比3：59, 同時(shí)腸道內(nèi)乳酸菌數(shù)量增加。由此可見, 木薯渣發(fā)酵飼料可以部分代替基礎(chǔ)日糧添加, 并且具有較好的飼喂效果。3結(jié) 論
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