菌酶協(xié)同發(fā)酵改善玉米—豆粕型飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的研究
近年來(lái),隨著飼用抗生素使用的逐步受限,如何保障畜禽健康成為我國(guó)畜牧業(yè)的一大挑戰(zhàn)。玉米和豆粕是目前仔豬生產(chǎn)上主要的飼料原料,而豆粕中的抗原蛋白、胰蛋白酶抑制劑及植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子會(huì)阻礙消化道吸收利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),不利于動(dòng)物生長(zhǎng)和健康。研究表明,生物發(fā)酵能有效降解飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子,促進(jìn)養(yǎng)分的消化吸收,改善動(dòng)物健康,減少飼用抗生素(促生長(zhǎng))的使用。選取合適的微生物進(jìn)行飼料的發(fā)酵能有效降解飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子,促進(jìn)養(yǎng)分的消化吸收,分泌的代謝產(chǎn)物如小肽,有機(jī)酸等利于改善動(dòng)物健康。 目前乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌被廣泛引用于飼料發(fā)酵。其中,乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸、細(xì)菌素等代謝產(chǎn)物有利于改善飼料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì),酵母菌能降解豆粕中的水蘇糖、棉子糖,而枯草芽孢桿菌對(duì)豆粕中抗原蛋白具有較強(qiáng)的降解效果。多菌株混合發(fā)酵理論上可以發(fā)揮不同菌株的發(fā)酵特性,但是不同菌株間存在可能存在拮抗作用,比如,當(dāng)米曲霉和干酪乳桿菌直接混合發(fā)酵豆粕,會(huì)降低米曲霉對(duì)豆粕中抗原蛋白的降解效果。而采用菌酶協(xié)同發(fā)酵,可以提高發(fā)酵過(guò)程中微生物對(duì)飼料中大分子物質(zhì)利用效率,如纖維素酶水解秸桿生成的單糖能為酵母菌合成菌體蛋白提供能量,進(jìn)而提高飼料品質(zhì)。 本研究以玉米、豆粕作為主要的發(fā)酵原料,通過(guò)單菌固態(tài)發(fā)酵比較不同菌株對(duì)飼料成分及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響。進(jìn)一步采用混菌發(fā)酵和菌酶協(xié)同的方式優(yōu)化飼料的發(fā)酵工藝,制備抗?fàn)I養(yǎng)因子含量低同時(shí)乳酸含量高的生物發(fā)酵飼料。隨后通過(guò)仔豬飼喂實(shí)驗(yàn)對(duì)比生物發(fā)酵復(fù)合飼料與并將發(fā)酵飼料飼喂仔豬,檢驗(yàn)飼料對(duì)于仔豬生長(zhǎng)性能的影響,為實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。 實(shí)驗(yàn)菌株:枯草芽孢桿菌BS12為本研究室自行分離的菌株,枯草芽孢桿菌CICC20076和枯草芽孢桿菌CICC20070:中國(guó)工業(yè)微生物菌株保藏管理中心(CICC);糞腸球菌EF(原始編號(hào)NCIMB10415):山東寶來(lái)利來(lái)公司;干酪乳桿菌LC和植物乳桿菌LP為本實(shí)驗(yàn)室自行分離的菌株;釀酒酵母:中國(guó)工業(yè)微生物菌株保藏管理中心(CICC); 豆粕:浙江某生物發(fā)酵公司。復(fù)合酶制劑:廣東某酶制劑公司。 主要儀器:Kjeltec8400 全自動(dòng)凱氏定氮儀:德國(guó)FOSS公司;L-8900 全自動(dòng)氨基酸分析儀:日本Hitachi公司; SpectraMaxM5酶標(biāo)儀:美國(guó)Molecular Devices公司等。 取9g豆粕、9g玉米粉、2g麩皮于100mL三角瓶中攪拌均勻后配成復(fù)合飼料,于105℃滅菌15min,按接種量5%分別加入枯草芽孢桿菌CICC20076、枯草芽孢桿菌CICC21076、枯草芽孢桿菌BS12、釀酒酵母CICC1520、糞腸球菌EF、干酪乳酸菌LC和植物乳桿菌LP的種子液,同時(shí)加入滅菌水至飼料總含水量為45%,發(fā)酵體系內(nèi)菌濃度達(dá)到1.0×107CFU/g,攪拌均勻后于37℃恒溫培養(yǎng),進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。實(shí)驗(yàn)根據(jù)菌的種類(lèi)不同共設(shè)7個(gè)組,每組3個(gè)重復(fù),其中枯草芽孢桿菌CICC20076組、枯草芽孢桿菌CICC21076組和枯草芽孢桿菌BS12組發(fā)酵24h,釀酒酵母CICC1520組發(fā)酵48h,糞腸球菌EF組、干酪乳酸菌LC組和植物乳桿菌LP組發(fā)酵48h。發(fā)酵結(jié)束后,將發(fā)酵飼料于60℃烘干,粉碎過(guò)60目篩后,測(cè)定發(fā)酵飼料中粗蛋白、豆粕抗原蛋白、中性洗滌纖維、酸溶蛋白以及乳酸含量。 將篩選出了芽孢桿菌BS12與糞腸球菌EF以不同比例添加入復(fù)合飼料,添加比如表1所示,按2.1方法先進(jìn)行24h好氧發(fā)酵,再進(jìn)行48h厭氧發(fā)酵,選取最優(yōu)的發(fā)酵比例。 為彌補(bǔ)細(xì)菌對(duì)纖維降解的不足。本研究中采用復(fù)合酶(主成分為:纖維素酶、甘露糖酶、果膠酶)強(qiáng)化飼料纖維的降解。分別以質(zhì)量比0.3%、0.5%、0.7%和1.0%加入復(fù)合飼料中,隨后經(jīng)過(guò)枯草芽孢桿菌BS12和糞腸球菌EF分步發(fā)酵后,測(cè)定發(fā)酵飼料中中性洗滌纖維含量。 兩步酶法測(cè)定發(fā)酵復(fù)合飼料的體外消化率參考Sakamoto等的方法進(jìn)行。分別取3g發(fā)酵復(fù)合飼料和未發(fā)酵復(fù)合飼料,裝入150mL三角瓶中。加入30mL 10000U/mL的胃蛋白酶溶液(3000U/mg,Sigma),用0.05mol/L KCl-HCl緩沖液調(diào)整至pH為2.0,隨后在39℃,150r/min條件下振蕩消化4h。隨后用1mol/L NaOH調(diào)整溶液pH為7.0,加入150mg胰蛋白酶(250U/mg,Sigma)于39℃,150r/min繼續(xù)消化4h。最后加入5mL 20%的磺基水楊酸溶液終止反應(yīng),沉淀30min。消化后的溶液在3000r/min條件下離心15min,棄上清。剩余的殘?jiān)?05℃條件下烘干處理4h,獲得殘?jiān)鼧颖?。參照?guó)標(biāo)《GB/T6432—1994》檢測(cè)發(fā)酵前后飼料中的粗蛋白含量,參照國(guó)標(biāo)《GB/T18246—2000》檢測(cè)殘?jiān)写值鞍缀桶被岬暮俊?/span> 體外消化率按照如下的公式計(jì)算: 玉米、豆粕和麩皮按45%、45%和10%的比例混合均勻,取200kg的玉米豆粕復(fù)合飼料,按5%比例分別接種芽孢桿菌BS12、糞腸球菌EF和5%的復(fù)合酶制劑,初始濕度控制在40%左右,室溫條件下(30℃)好氧發(fā)酵24h后;隨后裝入?yún)捬醢l(fā)酵袋,室溫條件下厭氧發(fā)酵48h后烘干粉碎待用。 選取192頭體重在(9.35±0.65)kg的49日齡健康仔豬(Duroc×Large white×Yorkshire),隨機(jī)分配至兩個(gè)處理組,每個(gè)處理6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)16頭。處理組1飼喂玉米豆粕基礎(chǔ)日糧(對(duì)照組),日糧中添加100mg/kg喹乙醇和50mg/kg吉他霉素;處理組2以10%發(fā)酵飼料替代基礎(chǔ)日糧中的玉米和豆粕(發(fā)酵飼料組),且日糧中不添加抗生素,實(shí)驗(yàn)期為24d。于實(shí)驗(yàn)期1d及24d稱(chēng)取仔豬初始體重及末重,每日記錄采食量、計(jì)算平均日增重。實(shí)驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。 飼料中抗原蛋白含量的測(cè)定采用龍科方舟試劑盒根據(jù)酶聯(lián)免疫(ELISA)法進(jìn)行測(cè)定;粗蛋白的測(cè)定參照《GB/T 6432—1994》;粗脂肪的測(cè)定參照《GB/T 6433—1994》;中性洗滌纖維的測(cè)定參照《GB/T 20806—2006》;飼料中鈣的測(cè)定參照《GB/T 6436—2002》;總磷的測(cè)定參照《GB/T 6437—2002》;酸溶蛋白的測(cè)定參照Mahmoudreza等的研究;飼料中乳酸采用羥基聯(lián)苯比色法測(cè)定;飼料pH采用pH計(jì)直接測(cè)定。 采用SPSS19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理,采用ANOVA進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05表示差異顯著,所有結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。 如表4所示,枯草芽孢桿菌BS12的比例提高有利于提高飼料中抗原蛋白的降解率和酸溶蛋白的含量。盡管糞腸球菌EF的含量減小,飼料中乳酸含量差異并不顯著。采用當(dāng)飼料中總菌量達(dá)到1.0×107CFU/g,芽孢桿菌BS12和糞腸球菌比例8:1時(shí),進(jìn)行先好氧發(fā)酵24h,再厭氧發(fā)酵48h,飼料中大豆球蛋白含量減少至8.31mg/g,β-伴球蛋白含量降低至6.44mg/g,酸溶蛋白相較發(fā)酵前提高6.16倍,乳酸含量達(dá)到116.57mg/g。 由表5可知,添加纖維素酶、甘露糖酶及果膠酶制備的后,發(fā)酵飼料中性洗滌纖維降解程度提高。添加量為0.30%、0.50%、0.70%和1.00%時(shí),相較于未發(fā)酵飼料,中性洗滌纖維降解率分別為35.41%、39.36%、40.32%和40.61%。但是抗原蛋白降解程度及乳酸含量變化并不顯著。 由圖1可見(jiàn),經(jīng)過(guò)發(fā)酵后,飼料中粗蛋白消化率也得到提高,6種必需氨基酸和5種非必須氨基酸體外消化率得到顯著提高。其中,蛋氨酸、苯丙氨酸分別提高15.15%和17.60%,丙氨酸,半胱氨酸,色氨酸分別提高了10.11%、10.05%和9.89%,粗蛋白消化率整體提高6.94%。 通過(guò)生物發(fā)酵降低飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量,從而提高動(dòng)物對(duì)飼料養(yǎng)分的消化利用率,已成為飼料工業(yè)發(fā)展的重要方向。目前研究多為發(fā)酵單一原料,如發(fā)酵豆粕、發(fā)酵菜粕和發(fā)酵DDGS。但是對(duì)于混合原料發(fā)酵的研究并不充分。本研究以玉米、豆粕和麩皮配制成混合原料,采用枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、糞腸球菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn),通過(guò)比較不同菌株對(duì)飼料中抗原蛋白降解程度、纖維降解程度及發(fā)酵后飼料中乳酸含量的影響,發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對(duì)飼料原料中蛋白和纖維的降解程度更高,乳酸菌產(chǎn)乳酸能力更強(qiáng)。Chi等也發(fā)現(xiàn)相較于酵母菌和乳酸菌,解淀粉芽孢桿菌對(duì)豆粕蛋白的降解程度更高。這可能是由于芽孢桿菌能分泌大量蛋白酶和纖維素酶,對(duì)大分子蛋白和纖維降解能力較強(qiáng)。乳酸菌雖然可以發(fā)酵產(chǎn)生乳酸,但是在固態(tài)發(fā)酵中對(duì)飼料中抗原蛋白的降解能力不強(qiáng)。 為綜合芽孢桿菌對(duì)豆粕抗原蛋白的降解特性與乳酸菌的產(chǎn)乳酸特性,本研究選取了枯草芽孢桿菌中對(duì)蛋白和纖維降解性較能強(qiáng)的BS12和乳酸菌中產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的糞腸球菌EF進(jìn)行混菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。但是,枯草芽孢桿菌為好氧細(xì)菌,而糞腸球菌為兼性厭氧細(xì)菌,完全進(jìn)行好氧發(fā)酵或厭氧發(fā)酵會(huì)抑制其中一種菌的生長(zhǎng)。Chen等采用分步發(fā)酵的方法用米曲霉先降低豆粕中的抗原蛋白,再用干酪乳桿菌發(fā)酵提高乳酸含量,降低豆粕pH。曲露等采用先好氧再厭氧的分步發(fā)酵方式,先降低菜籽粕中的硫甙和植酸,并提高粗蛋白及小肽含量,再通過(guò)厭氧發(fā)酵增加有機(jī)酸提高風(fēng)味。本研究采用同步加菌,先好氧發(fā)酵24h,再厭氧發(fā)酵48h的工藝。分步發(fā)酵降低了飼料中的抗原蛋白,且抗原蛋白降解程度和BS12單菌發(fā)酵相似,而乳酸含量也與EF單菌發(fā)酵結(jié)果相當(dāng)。這說(shuō)明,分步發(fā)酵工藝同樣適用于玉米-豆粕型復(fù)合飼料的發(fā)酵。 飼料原料中含有大量的植物纖維。其中中性洗滌纖維過(guò)高會(huì)增加食糜黏度,阻礙其在仔豬腸道內(nèi)的正常推進(jìn),增強(qiáng)飽腹感,降低采食量。非淀粉多糖酶有助于分解細(xì)胞壁,釋放營(yíng)養(yǎng)成分,提高干物質(zhì)、有機(jī)物及粗蛋白的消化利用率。本研究采用通過(guò)添加復(fù)合酶對(duì)發(fā)酵飼料進(jìn)一步優(yōu)化。結(jié)果顯示,發(fā)酵過(guò)程添加非淀粉多糖復(fù)合酶(纖維素酶、甘露糖酶和果膠酶),進(jìn)一步降低了飼料中的中性洗滌纖維含量。發(fā)酵后,粗蛋白、蛋氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸,半胱氨酸和色氨酸的體外消化率提高明顯。其中,蛋氨酸、丙苯氨酸和色氨酸是豬日糧中的必需氨基酸,而半胱氨酸是半必需氨基酸。倪良振等研究發(fā)現(xiàn),在含5.8%酸性洗滌纖維的日糧中添加纖維素酶極顯著提高煙臺(tái)黑豬對(duì)蛋氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸的回腸表觀(guān)消化率。因此,采用非淀粉多糖酶和枯草芽孢桿菌、糞腸球菌協(xié)同發(fā)酵降解飼料中的大分子蛋白和纖維,產(chǎn)生小分子肽和游離氨基酸,更有利于仔豬對(duì)氨基酸的消化利用。 仔豬飼喂實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明,相較于添加了抗生素的對(duì)照組,采用10%的菌酶協(xié)同發(fā)酵復(fù)合飼料有利于提高仔豬生長(zhǎng)性能,且料肉比和腹瀉率并未發(fā)生顯著變化。 本研究通過(guò)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)篩選了1株高效降解豆粕抗原蛋白的枯草芽孢桿菌BS12和1株產(chǎn)乳酸能力較強(qiáng)的糞腸球菌EF,用于玉米豆粕型復(fù)合飼料的發(fā)酵。結(jié)果顯示,將BS12與EF按總菌量1.0×107CFU/g,菌量比8:1接種于復(fù)合飼料,同時(shí)接入0.5%的復(fù)合酶,發(fā)酵72h,可降解飼料中80%的大豆抗原蛋白,且乳酸含量達(dá)到122.18mmol/kg。所得發(fā)酵復(fù)合飼料提高了仔豬采食量和日增重,有利于提高仔豬生長(zhǎng)性能,減少飼用抗生素使用。
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