甘氨酸對脂多糖刺激引起的斷奶仔豬腸道能量代謝紊亂的影響
腸道是重要的消化、吸收器官，也是機體重要的免疫器官，在免疫應激中最易受損（李爽，2013）。脂多糖（LPS）可刺激免疫系統(tǒng)，造成免疫應激（劉玉蘭等，2008）。研究發(fā)現(xiàn)，LPS 刺激可造成胃腸道蠕動減慢，腸黏膜缺血和缺氧（劉堅等，2009）。此外，LPS 刺激可導致機體釋放過量的炎性細胞因子，產(chǎn)生大量的自由基，造成脂質(zhì)過氧化反應，而這些變化會破壞線粒體結(jié)構(gòu)完整性和細胞色素氧化酶系統(tǒng)，阻礙呼吸鏈的電子傳遞，造成ATP 合成障礙，使腸道能量代謝紊亂（李爽，2013；劉堅等，2009）。
甘氨酸（Gly）在傳統(tǒng)氨基酸分類上是一種非必需氨基酸，研究表明，日糧中添加Gly 對機體的發(fā)育起著重要作用， 是保證哺乳動物最大生長速率的條件性必需氨基酸（Wu 等，2013）。仔豬日糧中添加Gly 對提高采食量， 增強機體抗氧化能力以及維持腸道完整性有重要意義（Wu 等，2013）。Gly 可抑制鈣蛋白酶的活性， 保護細胞免受三磷酸腺苷（ATP）衰竭的影響（谷俊朝等，2005）。另外，Gly 分解后可生成乙酰輔酶A，進一步參與三羧酸（TCA）循環(huán)（王鏡巖等，2002）。目前關(guān)于Gly對腸道能量代謝影響的研究報道較少。本試驗通過給斷奶仔豬注射LPS 建立腸道損傷模型（劉玉蘭等，2008）， 研究日糧中添加Gly 對腸道能量代謝水平和LPS 刺激導致腸道損傷的影響。
1材料與方法
1.1 試驗材料
Gly和丙氨酸純度均大于99.5%，購自武漢某公司。LPS（大腸桿菌血清型055:B5）購自Sigma公司，溶于生理鹽水，以100μg/kgBW劑量注射。
1.2 試驗動物與飼養(yǎng)管理
選擇24頭健康、體況相近（7.17±0.41）kg的杜×長×大斷奶仔豬[（21±1）d日齡斷奶]，根據(jù)體重相近的原則隨機分為4個處理組，每組6頭豬。飼養(yǎng)周期35d，預試7d待仔豬適應試驗日糧后，進行正式試驗。試驗前的驅(qū)蟲及消毒等程序根據(jù)豬場飼養(yǎng)管理規(guī)范進行。飼養(yǎng)過程中，仔豬可自由飲水采食。豬舍溫度維持25～27℃。
1.3 試驗飼糧和設(shè)計
參照NRC（1998）仔豬飼養(yǎng)標準配制基礎(chǔ)日糧，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。在各組飼糧中添加丙氨酸以達到等氮。本試驗分為4個處理組，分別為對照組、LPS組、1.0%Gly組和2.0%Gly組。對照組和LPS組飼喂基礎(chǔ)日糧，后兩組飼喂分別添加了1.0%Gly和2.0%Gly的日糧。正式試驗第28天時，LPS組、1.0%Gly組和2.0%Gly組仔豬注射LPS，對照組注射相同劑量生理鹽水。
1.4 腸道樣品采集與處理
注射LPS或生理鹽水4h后，仔豬注射戊巴比妥鈉，待充分麻醉后進行屠宰，剖開腹腔取空腸和回腸樣品置于冰上。剖開小腸，用4℃生理鹽水沖洗腸段。待濾紙充分吸干水分后，用載玻片刮取空腸和回腸黏膜，分裝至離心管中，凍存待測。
1.5 檢測指標
1.5.1 腺苷酸含量的測定
腸道的樣品參照李爽（2013）的方法進行前處理，采用反向高效液相色譜系統(tǒng)測定樣品中ATP、二磷酸腺苷（ADP）和一磷酸腺苷（AMP）的濃度，標準品也在相同的色譜條件下測定。通過標準品對應的峰面積和濃度建立標準曲線方程，根據(jù)所測樣品的峰面積計算腸道三種腺苷酸（ATP、ADP和AMP）含量，以μg/g黏膜重表示。腺苷酸池（TAN）和能荷（EC）水平的計算參照下述公式（李爽，2013）：
TAN＝ATP＋ADP＋AMP；
EC＝（ATP＋1/2ADP）/（ATP＋ADP＋AMP）。
1.5.2 TCA循環(huán)關(guān)鍵酶活性的測定
TCA循環(huán)關(guān)鍵酶包括檸檬酸合成酶（CS）、異檸檬酸脫氫酶（ICDH）和α-酮戊二酸脫氫酶復合體（α-KGDHC），其酶含量的測定方法與李爽（2013）一致，采用ELISA法進行測定。
1.5.3 能量代謝相關(guān)因子mRNA表達量的測定
測定的基因包括腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirt1）、過氧化物酶體增殖物受體-α輔激活因子1α（PGC-1α）。組織總RNA提取、cDNA合成、Real-timePCR參照李爽（2013）的方法。待測基因及內(nèi)參基因GAPDH的引物見表2。所測基因的mRNA表達量采用2-ΔΔCT計算（Livak和Schmittgen，2001）。
1.6 統(tǒng)計分析
試驗數(shù)據(jù)采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和LSD多重比較。統(tǒng)計結(jié)果用平均值和SEM表示。P≤0.05表示顯著差異，0.05＜P≤0.10表示具有差異顯著性趨勢。
2結(jié)果與分析
2.1 Gly對LPS刺激仔豬腸道能量代謝指標的影響
由表3可知，與對照組相比，LPS刺激導致空腸ATP含量、TAN和EC水平分別下降44.5%、21.2%、19.4%，AMP/ATP比值升高96.1%，回腸ATP、ADP含量和TAN水平降低21.9%、12.9%、18.0%（P＜0.05）。與LPS組相比，1.0%Gly使空腸TAN水平提高14.9%（P＝0.05），有升高空腸AMP含量的趨勢（P＜0.10）；2.0%Gly有提高空腸ATP含量和EC水平的趨勢（P＜0.10）。
2.2 Gly對LPS刺激仔豬腸道TCA循環(huán)關(guān)鍵酶活性的影響
由表4可知，與對照組相比，LPS刺激導致空腸TCA循環(huán)關(guān)鍵酶CS、ICDH和α-KGDHC的活性分別降低15.0%、13.2%、23.2%，回腸TCA循環(huán)關(guān)鍵酶CS、ICDH和α-KGDHC的活性分別降低24.3%、23.5%、51.8%（P＜0.05）。1.0%Gly有提高回腸α-KGDHC活性的趨勢（P＜0.10）；2.0%Gly使空腸ICDH和回腸α-KGDHC活性分別提高15.9%和41.3%（P＜0.05），同時有提高回腸CS活性的趨勢（P＜0.10）。
2.3 Gly對LPS刺激仔豬腸道能量代謝相關(guān)基因mRNA表達的影響
由表5可知，與對照組相比，LPS刺激導致空腸PGC-1α、回腸Sirt1和PGC-1α的mRNA表達量分別降低55.0%、18.0%、55.0%（P＜0.05）。與LPS組相比，1.0%Gly使空腸PGC-1α的mRNA表達水平提高64.4%（P＜0.05）；2.0%Gly使空腸PGC-1α、回腸Sirt1和PGC-1α的mRNA表達水平分別提高51.1%、22.0%、60.0%（P＜0.05）。
討 論
ATP是細胞的重要供能物質(zhì)，細胞內(nèi)ATP與ADP可相互轉(zhuǎn)換，進而維持ATP的動態(tài)平衡，持續(xù)地為細胞提供能量（王鏡巖等，2002）。另外，細胞中ATP、ADP和AMP含量的動態(tài)變化可調(diào)控細胞的代謝過程（王鏡巖等，2002）。TAN為三種腺苷酸之和，是描述細胞代謝和能量儲備狀態(tài)的重要參數(shù)（楊震國等，2012）。為了衡量細胞中高能磷酸鍵的多少，1968年Atkinson提出了EC的概念，EC可動態(tài)調(diào)節(jié)細胞的能量平衡（楊震國等，2012）。
本試驗中，LPS刺激導致腸道ATP和ADP含量、TAN和EC水平下降，AMP/ATP比值升高，表明LPS刺激阻礙了腸黏膜的能量代謝。劉堅等（2009）研究表明，LPS刺激后腸上皮細胞ATP分解代謝增強，加劇了腸道能量供應不足；Bradley（1979）發(fā)現(xiàn)LPS自身及其介導的腸道黏膜組織缺血缺氧和過氧化損傷會破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)的完整性，抑制氧化磷酸化相關(guān)酶如ATP合成酶和電子傳遞鏈中相關(guān)酶如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）脫氫酶的活性，進而減少ATP合成，導致機體能量代謝紊亂。本試驗結(jié)果顯示，日糧中添加Gly提高了空腸ATP和AMP含量、TAN和EC水平。Wu等（2013）發(fā)現(xiàn)飼糧中約30%的Gly在幼齡仔豬小腸的首過代謝中被降解產(chǎn)能。有研究表明，Gly可通過斯提柯蘭氏反應產(chǎn)生乙酸，給宿主特別是腸道上皮細胞提供能量（朱偉云等，2014）。因此，我們推測Gly可被機體利用產(chǎn)能，緩解LPS刺激導致的仔豬腸道能量不足。
TCA是需氧生物體重要的能量生成途徑，機體對ATP的需求決定了TCA循環(huán)的速率（王鏡巖等，2002）。CS、ICDH和α-KGDHC是TCA循環(huán)中的三種關(guān)鍵限速酶，均存在真核細胞的線粒體中（王鏡巖等，2002）。CS是TCA循環(huán)的第一個關(guān)鍵限速酶，可催化乙酰輔酶A生成檸檬酸，調(diào)控生物體的能量代謝（史紅超和蘇鐵柱，2011）。ICDHs可依據(jù)輔酶分為NAD-ICDH和NADP（酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）-ICDH，催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸（史紅超和蘇鐵柱，2011）。α-KGDHC是TCA中一個關(guān)鍵調(diào)控位點，可催化α-酮戊二酸生成琥珀酰輔酶A（王鏡巖等，2002）。
本試驗中，LPS刺激導致TCA循環(huán)三種限速酶的活性下降，這與李爽（2013）的研究結(jié)果類似。本試驗結(jié)果顯示，Gly能顯著提高腸道TCA循環(huán)三種限速酶的活性，表明Gly能提高TCA循環(huán)的反應速率，使機體獲得更高的能量供給。有研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激產(chǎn)生的自由基可造成TCA循環(huán)酶的氧化損傷（Kowaltowski和Vercesi，1999），而Gly具有抗氧化能力，可清除腸道的自由基（杜瑞平等，2015）。因此，我們猜測Gly可能通過清除LPS刺激產(chǎn)生的自由基，進而對TCA循環(huán)限速酶起保護作用，最終改善腸道的結(jié)構(gòu)和功能。此外，Gly也可能在機體內(nèi)分解生成乙酰輔酶A進而激活CS，促進TCA循環(huán)（史紅超和蘇鐵柱，2011；王鏡巖等，2002）。
AMPK是細胞能量變化的感受器，當機體缺乏能量或營養(yǎng)時，AMP/ATP比值上升，AMPK被磷酸化激活，進而調(diào)控相關(guān)信號通路使能量恢復至正常水平（王艷等，2013）。AMPK激活后可提高NAD＋水平進而影響Sirt1的活性（王艷等，2013）。Sirt1屬于去乙酰化酶（Sirtuin）家族，可促進糖異生和脂代謝以及調(diào)控胰島β細胞分泌胰島素來增加機體ATP的含量（趙靜姝和王蓉，2011）。Sirt1也可催化PGC-1α脫乙酰而使其激活（趙靜姝和王蓉，2011）。PGC-1α是一種與能量代謝密切相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄輔激活因子，能通過增強細胞呼吸率和利用能量底物產(chǎn)生能量進而使細胞適應環(huán)境的改變（李博等，2011）。
本試驗中，LPS刺激顯著降低Sirt1和PGC-1α的mRNA表達量，這與Kang等（2015）的結(jié)果類似。本試驗結(jié)果顯示，Gly緩解了LPS刺激導致的Sirt1和PGC-1α的mRNA表達量的降低。Gly可能通過直接或者間接調(diào)節(jié)Sirt1和PGC-1α，從而提高機體產(chǎn)能。試驗中LPS刺激和Gly的添加對腸道AMPKα1和AMPKα2的mRNA表達量均無顯著影響。研究表明，細胞中ATP含量降低，上升的AMP達到一定水平，才能激活AMPK的活性（王艷等，2013；Wijesekara等，2006），而本試驗中可能是因為仔豬腸道能量變化沒有達到AMPK的感受范圍，所以其表達量無顯著變化。
4結(jié) 果
本試驗結(jié)果表明，Gly可緩解LPS 刺激導致的腸道能量代謝紊亂，降低TCA循環(huán)關(guān)鍵酶活性以及Sirt1 和PGC-1α 的mRNA 表達量。
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