復(fù)合菌混合發(fā)酵馬鈴薯薯渣與莖葉的工藝研究
每生產(chǎn)1t馬鈴薯淀粉將產(chǎn)生5t左右薯渣，對(duì)馬鈴薯薯渣最經(jīng)濟(jì)的利用方式是直接作為禽畜飼料。但鮮薯渣蛋白質(zhì)含量低，直接食用不能滿足家畜營養(yǎng)需求，且薯渣含水量高達(dá)80％左右，呈現(xiàn)出典型的膠體特性，若烘干制成干飼料則成本過高，導(dǎo)致其成為廢棄物并造成環(huán)境污染。資源化利用營養(yǎng)物質(zhì)成為馬鈴薯薯渣處理的關(guān)鍵。馬鈴薯鮮渣中粗蛋白含量為1％，粗脂肪含量為0.16％，粗纖維和果膠含量均為9.4％，糖類含量約為1％，是良好的微生物基質(zhì)。因此，前人利用馬鈴薯薯渣進(jìn)行液態(tài)或固態(tài)發(fā)酵制備飼料，但液態(tài)發(fā)酵多為耗氧發(fā)酵，能源損耗高；薯渣干制成本高，以鮮薯渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，須添加米糠、麥麩等吸收劑吸收水分，又需增加額外成本。我國馬鈴薯莖葉資源年產(chǎn)量達(dá)1.2億～1.8億t，馬鈴薯莖葉干物質(zhì)中，粗蛋白含量占16.2％、粗纖維含量占20.8％、粗脂肪含量占1.8％，具有較好飼用價(jià)值。但馬鈴薯莖葉龍葵素含量高、適口性差，不宜直接飼喂，大部分被農(nóng)戶丟棄。目前，對(duì)馬鈴薯莖葉的利用主要是作為青貯飼料使用，但因其莖葉中糖含量較低(0.3％～0.8％)，不利于乳酸菌繁殖，單獨(dú)發(fā)酵腐爛比較嚴(yán)重?？紤]到馬鈴薯薯渣和莖葉一定程度上營養(yǎng)互補(bǔ)，且預(yù)處理后的馬鈴薯莖葉還可降低薯渣黏度、吸收薯渣多余水分，因此，本研究將馬鈴薯薯渣和預(yù)處理后的馬鈴薯莖葉按實(shí)際所得比例混合，采用多菌協(xié)生混合發(fā)酵，以黑曲霉菌(Aspergillus niger)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)與啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的復(fù)合菌劑接種進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白質(zhì)飼料，變廢為寶，為薯渣和莖葉的綜合利用提供參考。
1材料和方法1.1 材料來源和培養(yǎng)基主成分的制備
馬鈴薯莖葉和塊莖均來自于貴陽農(nóng)戶種植的同一品種馬鈴薯。其中，莖葉在收薯前的3～5 d收割，晾曬一定時(shí)間后，切細(xì)至2(3m備用，完成馬鈴薯莖葉預(yù)處理；將得到的馬鈴薯塊莖在實(shí)驗(yàn)室中模擬工廠生產(chǎn)淀粉的工藝自制馬鈴薯薯渣。薯渣與鮮莖葉的質(zhì)量比為4：5，將薯渣與預(yù)處理后莖葉按實(shí)際所得比例混合，作為培養(yǎng)基使用。
1.2 茵劑的制備
黑曲霉菌、植物乳桿菌、啤酒酵母均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。
菌種活化與擴(kuò)大培養(yǎng)：黑曲霉菌于麥芽汁液體培養(yǎng)基中28℃活化培養(yǎng)72 h，然后取10 mL于馬鈴薯培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、水1 000 mL，pH值自然)上培養(yǎng)72 h，備用；植物乳桿菌于液體種子培養(yǎng)基(蛋白胨1％、牛肉膏1％、葡萄糖4％、乙酸鈉0.5％、酵母膏0.5％、檸檬酸二銨0.2％、磷酸氫二鉀0.2％、硫酸鎂0.02％)中36℃培養(yǎng)12 h，然后取10 mL于馬鈴薯培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h，備用；啤酒酵母于基礎(chǔ)培養(yǎng)基(葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L)中28℃培養(yǎng)24 h，然后取20 mL分裝于裝有麥芽汁培養(yǎng)基的三角瓶中，無菌條件下每瓶接人活化后酵母菌2滿環(huán)，28℃，160 r/min搖床培養(yǎng)24 h。
復(fù)合菌劑的制備：根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，復(fù)合菌劑為擴(kuò)大培養(yǎng)后的黑曲霉菌、啤酒酵母與植物乳桿菌按2：2：1體積比混合而成。
1.3 發(fā)酵工藝的優(yōu)化
將薯渣與莖葉的混合物加入帶蓋塑料桶(規(guī)格為5 L)中，添加氮源、過磷酸鈣、菌劑，拌勻，桶面上蓋1層塑料膜密封。室溫(約10~20℃)條件下厭氧發(fā)酵20 d。
1.3.1 莖葉水分對(duì)發(fā)酵效果的影響取同質(zhì)量新
鮮馬鈴薯莖葉7份，分別晾曬0、8、16、24、32、40、48 h后得到含水量86％、70％、62％、50％、44％、37％、30％的馬鈴薯莖葉，切細(xì)，按實(shí)際比例加入同來源薯渣，混勻后各取出1 000 g，分別加入(NH4)2SO4 60 g、過磷酸鈣95 g，根據(jù)薯渣與莖葉的混合質(zhì)量按接種量5％添加復(fù)合菌劑，發(fā)酵20 d。然后測(cè)定各份產(chǎn)物中真蛋白含量，評(píng)價(jià)發(fā)酵產(chǎn)物感官特征。
1.3.2 添加營養(yǎng)成分及茵劑對(duì)發(fā)酵效果的影響
根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)處理，處理1：對(duì)照，將1 000 g薯渣與莖葉的混合物置人桶中，不加任何物料，發(fā)酵20 d；處理2：不發(fā)酵處理，在1 000 g薯渣與莖葉的混合物中加入尿素60 g、過磷酸鈣95 g，根據(jù)薯渣與莖葉的混合質(zhì)量按接種量5％添加復(fù)合菌劑(下同)，拌勻，直接取樣測(cè)定；處理3：在1 000 g薯渣與莖葉的混合物中加入尿素60 g、過磷酸鈣95 g，菌劑接種量為5％，拌勻，發(fā)酵20 d；處理4：在1 000 g薯渣與莖葉的混合物中加入尿素60 g，菌劑接種量5％，拌勻，發(fā)酵20 d；處理5：在1 000 g薯渣與莖葉的混合物中加入(NH4)2SO4 60 g、過磷酸鈣95 g，菌劑接種量5％，拌勻，發(fā)酵20 d；處理6：在1 000 g薯渣與莖葉的混合物中加入NaNO4 60 g、過磷酸鈣95 g，菌劑接種量為5％，拌勻，發(fā)酵20 d。測(cè)定以上6種處理產(chǎn)物的真蛋白含量。
1.3.3 復(fù)合菌接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響將薯渣
與含水量50％左右的馬鈴薯莖葉按實(shí)際比例混合加入塑料桶中，按其質(zhì)量的6％添加(NH4)2SO4、9.5％添加過磷酸鈣，根據(jù)薯渣與莖葉的混合質(zhì)量分別接種1％、3％、5％、7％、9％的復(fù)合菌劑，拌勻裝入桶中，室溫厭氧發(fā)酵20 d，分別測(cè)定5種接種量處理發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白含量。
1.4 優(yōu)化后發(fā)酵工藝的效果
根據(jù)1.3篩選得到的優(yōu)化工藝，將預(yù)處理后水分為50％的馬鈴薯莖葉與馬鈴薯薯渣按質(zhì)量比1：1.1混合，取2份該比例的混合物。第一份直接取樣，用作對(duì)照；在另一份混合物中添加(NH4)2SO4 60g、過磷酸鈣95g，按接種量5％添加復(fù)合菌劑，置人桶中密封處理，厭氧發(fā)酵20 d。分別測(cè)定發(fā)酵前、后薯渣與莖葉混合物中硫胺素、煙酸、葉酸、真蛋白、鈣、磷、尿素、龍葵素等的含量及蛋白質(zhì)可消化率。
1.5 測(cè)定項(xiàng)目及方法
水分含量測(cè)定采用減壓干燥法(GB/T14769~93)；真蛋白含量測(cè)定采用硫酸銅沉淀一凱氏定氮法；蛋白質(zhì)可消化率參照文獻(xiàn)制樣并用甲醛法檢測(cè)消化前后樣品中氮含量并計(jì)算；硫銨素含量測(cè)定采用GB/T5009.84~2003；葉酸含量測(cè)定采用GB/T5009.211~2008；煙酸含量測(cè)定采用GB/T5009.89~2003；粗纖維含量測(cè)定采用酸堿處理法(GB 5009.10~85)；磷含量測(cè)定采用鉬藍(lán)比色法(GB/T 12393~1990)；鈣含量測(cè)定采用乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合滴定法(GB/T 6436~2002)；尿素含量測(cè)定采用二甲氨基苯甲醛比色法；酸度測(cè)定采用GB/T 5517~2010；乳酸含量測(cè)定參照NY 82.12~1988；龍葵素含量測(cè)定采用乙醇一乙酸法雙溶劑提取- HPLC法。
2結(jié)果與分析2.1 馬鈴薯莖葉含水量對(duì)發(fā)酵效果的影響
由表1可知，隨著莖葉含水量的減少，發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量先增加后降低。當(dāng)莖葉含水量為50％時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量最高，有酒香味和淡淡的酸香味，無腐敗和惡臭氣味，拿到手里感到松散、質(zhì)地柔軟、濕潤(rùn)。環(huán)境中水分直接影響微生物生長(zhǎng)，水分含量為50％的莖葉與薯渣混合后，培養(yǎng)基含水量在67％左右，適合微生物對(duì)水分的要求(65％~70％)。在薯渣中加入預(yù)處理后含一定水分的馬鈴薯莖葉，而不是添加干制后的馬鈴薯莖葉，不僅可以節(jié)約于制莖葉的成本，還可降低莖葉干制過程中引起的霉菌滋生和營養(yǎng)成分損失。因此，選擇水分含量50％的馬鈴薯莖葉與薯渣混合后作為培養(yǎng)基使用。
2.2 添加營養(yǎng)成分及菌劑對(duì)發(fā)酵效果的影響
據(jù)表2可見，處理3、4、5、6發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量明顯高于處理1、2，說明培養(yǎng)基中加入營養(yǎng)成分和接人菌劑有助于提高發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量。處理3真蛋白含量比處理4高20.8％，表明添加過磷酸鈣有助于發(fā)酵。比較尿素、(NH4)2SO4和NaNO3(處理3、5、6)3種氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量的影響發(fā)現(xiàn)，(NH4)2SO4的效果最好，NaNO3的效果最差。處理5發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量比處理2高3.8倍以上，說明添加菌劑進(jìn)行發(fā)酵大幅度提高了蛋白質(zhì)含量。因此，1 000 g薯渣與莖葉的混合物中添加(NH4)2SO4 60 g、過磷酸鈣95 g，按接種量5％添加復(fù)合菌劑，置入桶中密封處理，厭氧發(fā)酵20 d，發(fā)酵效果最好。
2.3 復(fù)合菌劑接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響
由表3知，隨著復(fù)合菌劑接種量的增加，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量先增加后趨于穩(wěn)定，當(dāng)復(fù)合菌劑添加量為5％、7％、9％時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量分別為19.3％、19.5％、19.4％，說明復(fù)合菌劑添加量為5％時(shí)即可滿足發(fā)酵對(duì)菌劑量的要求。故菌劑接種量確定為5％。復(fù)合菌中的3種微生物均為微生物飼料生物安全通用技術(shù)準(zhǔn)則附錄中所規(guī)定使用的生產(chǎn)菌種。試驗(yàn)中采用乳酸菌和酵母，不僅可提高飼料中的蛋白質(zhì)含量，因發(fā)酵產(chǎn)物有乳酸和乙醇，還能改善飼料風(fēng)味，提高牲畜的食欲；加入黑曲霉，利用培養(yǎng)基中殘余的氧氣，有利于培養(yǎng)基中的纖維素分解成糖類物質(zhì)，補(bǔ)充營養(yǎng)源，還可促進(jìn)乳酸菌和酵母對(duì)培養(yǎng)基的后續(xù)發(fā)酵。
2.4 優(yōu)化工藝發(fā)酵前后重要指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果
由表4可知，薯渣與莖葉混合物發(fā)酵后真蛋白含量較發(fā)酵前提高328.26％，蛋白質(zhì)可消化率提高172.79％。蛋白質(zhì)降解為肽、短肽和氨基酸后，才能被動(dòng)物吸收利用，采用蛋白質(zhì)可消化率評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值最準(zhǔn)確。因此，發(fā)酵后真蛋白數(shù)量和品質(zhì)都大幅度提高。
發(fā)酵前，薯渣與莖葉混合物中硫胺素、煙酸和葉酸3種維生素含量較少，發(fā)酵后三者含量分別提高了6 251.72％、755.32％、767.52％，這3種維生素對(duì)動(dòng)物均有重要生理功能。說明接人復(fù)合菌劑發(fā)酵，有利于提高飼料維生素含量。
厭氧發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量可用乳酸含量和pH值評(píng)價(jià)，優(yōu)質(zhì)青貯飼料pH值一般小于4.20，同時(shí)乳酸含量高。高含量乳酸引起的低pH值可降低有害微生物數(shù)量，從而提高發(fā)酵品質(zhì)。由表4可知，發(fā)酵前薯渣與莖葉混合物中乳酸含量為0.08％，發(fā)酵后為1.53％，乳酸含量提高了1 812.50％；發(fā)酵前pH值為6.14，發(fā)酵后pH值為3.87，低于4.20，說明發(fā)酵效果較好。
復(fù)合菌劑處理薯渣與莖葉混合物發(fā)酵后粗纖維含量(17.3％)比處理前(38.9％)降低55.53％，這是復(fù)合微生物共同協(xié)作的結(jié)果，微生物讓纖維結(jié)構(gòu)更為松散和暴露，有利于纖維素復(fù)合酶酶解纖維素。鈣、磷是動(dòng)物骨骼和牙齒的組成元素，發(fā)酵產(chǎn)物中鈣、磷含量較發(fā)酵前分別增加了1 11.11％、411.1 1％。
飼料中尿素含量安全值為不超過1％，安全值下尿素對(duì)牲畜發(fā)育無害，發(fā)酵產(chǎn)物可作為粗飼料使用。由表4可知，薯渣與莖葉混合物發(fā)酵前尿素添加量為6.0％，發(fā)酵后尿素含量降低為0.8％，尿素含量大幅度降低說明其在發(fā)酵時(shí)作為氮源被微生物消耗。發(fā)酵后尿素殘留量(0.8％)低于1％，表明發(fā)酵產(chǎn)物可作為畜禽飼料使用。馬鈴薯植株和塊莖中都含有龍葵素，人、畜超量攝入龍葵素后會(huì)引起急性中毒，嚴(yán)重時(shí)危及生命。薯渣與莖葉混合物發(fā)酵前龍葵素含量為0.19％，發(fā)酵后降低了84.21％，僅為0.03％。這可能是龍葵素在堿性條件下穩(wěn)定存在，酸性條件下分子結(jié)構(gòu)中糖苷鍵發(fā)生水解¨⋯，發(fā)酵后低pH值使龍葵素水解而含量降低。發(fā)酵后龍葵素含量(0.03％)也低于龍葵素含量安全值(100 mg/kg)。
本研究表明，在1 000 g薯渣與莖葉(含水量50％)按實(shí)際比例混合的混合物中，添加(NH4)2SO4。60 g、過磷酸鈣95 g，復(fù)合菌劑(以黑曲霉、植物乳桿菌和啤酒酵母3種菌種制成)接種量為5％，厭氧發(fā)酵20 d，與發(fā)酵前相比，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量提高328.26％，蛋白質(zhì)可消化率提高172.79％；硫胺素、煙酸、葉酸、乳酸、鈣、磷含量分別提高了6251.72％、755。32％、767.52％、1 812.50％、111.11％、411.11％：粗纖維含量降低55.53％、尿素和龍葵素殘留量均在安全范圍內(nèi)。因此，通過復(fù)合菌劑發(fā)酵薯渣與莖葉的混合物，不僅可提高飼料的品質(zhì)和安全性，還可以擴(kuò)大飼料資源。
本研究采用生料固態(tài)發(fā)酵薯渣與莖葉的混合物，與液態(tài)發(fā)酵相比，具有簡(jiǎn)易、低投資、低能耗等優(yōu)點(diǎn)，可把發(fā)酵底物、菌體及其代謝產(chǎn)物全部利用，既可保留活性成分又不產(chǎn)生廢液污染。薯渣與莖葉的混合物中添加復(fù)合菌劑后發(fā)酵，真蛋白含量提高328.26％，原因是微生物大量繁殖，單細(xì)胞蛋白含量的提高引起發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量增加。單細(xì)胞蛋白營養(yǎng)豐富，含有18～20種氨基酸，富含多種維生素。
本研究采用復(fù)合菌劑對(duì)薯渣與莖葉的混合物進(jìn)行接種，植物乳桿菌和酵母菌均為益生菌，能夠改善畜禽的腸道環(huán)境，提高畜禽免疫力。在復(fù)合菌劑作用下，產(chǎn)生乙醇、乳酸和醋酸，這些發(fā)酵產(chǎn)物的積累，既可保持飼料不腐敗，又能改善其營養(yǎng)價(jià)值和適口性。
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