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1.1 試驗材料

RSM:購自御康農(nóng)業(yè)科技有限公司。FRSM:將RSM與麥麩按7∶3的比例混合, 然后接種10%的微生物混合菌液 (菌液活菌數(shù)≥1×10⁹CFU/mL) , 加1%紅糖, 料水比1.0∶1.2。將上述物質(zhì)混合均勻后, 裝至發(fā)酵桶密封, 厭氧發(fā)酵72 h以上, 得到FRSM。發(fā)酵菌種:短乳桿菌 (Lactobacillus brevis) 和短小芽孢桿菌 (Bacillus pumilus) 均為本實驗室保藏菌種, 菌種比例為1∶2。FRSM相比于RSM其pH下降了1.68, 營養(yǎng)物質(zhì)粗蛋白質(zhì)、水溶性蛋白、酸溶性蛋白和粗脂肪的含量與RSM相比分別提高了1.91%、52.88%、44.40%和24.27%;抗營養(yǎng)因子中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維的含量分別降低了5.21%、0.38%, 異硫氰酸酯降解率達到91.92%, 噁唑烷硫酮降解率達到100.00%。RSM發(fā)酵前后營養(yǎng)物質(zhì)和抗營養(yǎng)因子含量變化見表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

動物試驗在重慶市畜牧科學院雙河實驗基地進行, 采用常規(guī)飼養(yǎng)管理, 嚴格執(zhí)行消毒制度。試驗期間, 試驗豬自由采食、自由飲水, 試驗期7周。

1.4 樣品采集與測定指標

1.4.1 生長性能的測定

試驗豬在試驗開始和結(jié)束時分別于早晨空腹稱重, 試驗期間記錄每個重復的飼糧消耗, 計算平均日采食量 (ADFI) 、ADG和F/G。

1.4.2 血清生化指標的測定

試驗結(jié)束空腹稱重后, 以各組別每個重復為單位, 每組選取6頭豬進行前腔靜脈采血。血樣經(jīng)3 500 r/min離心10 min, 分離所得血清分裝于Eppendorf管中, 置于-20℃冷凍保存, 待測。

血清葡萄糖 (GLU) 、總膽固醇 (T-CHOL) 、總蛋白 (TP) 、尿氮 (UN) 、甲狀腺素 (T₄) 和三碘甲狀腺原氨酸 (T₃) 含量由重慶市榮昌縣永榮醫(yī)院協(xié)助檢測, 試劑盒購自南京建成生物工程研究所, 測定儀器為Glamour 2000全自動生化分析儀。

1.4.3 抗氧化能力指標的測定

血清超氧化物歧化酶 (SOD) 活性用黃嘌呤氧化酶法測定, 血清谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-Px) 活性用比色法測定, 血清總抗氧化能力 (T-AOC) 用Fe³⁺還原法測定, 血清丙二醛 (MDA) 含量用硫代巴比妥酸法測定。試劑盒購自南京建成生物工程研究所, 測定儀器為U-3900型分光光度計, 具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.4.4 免疫功能指標的測定

血清免疫球蛋白 IgA、IgG、IgM和腫瘤壞死因子-α (TNF-α) 含量均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA) 試劑盒測定。試劑盒購自南京建成生物工程研究所, 測定儀器為華東電子DG5033A酶標儀, 具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行初步處理, 再用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析, 若有顯著差異則用Duncan氏法進行多重比較, P<0.05表示差異顯著, P<0.01表示差異極顯著。試驗結(jié)果采用平均值±標準誤表示。

2.1 FRSM替代豆粕對生長豬生長性能的影響

由表3可知, 各組的ADFI、ADG和F/G均差異不顯著 (P>0.05) , Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ組的ADFI分別比Ⅱ組提高了6.11%、0.56%和2.22%, ADG分別比Ⅱ組提高了12.54%、5.54%和5.67%, F/G分別比Ⅱ組下降了8.54%、7.12%和6.05%。

3.1 FRSM替代豆粕對生長豬生長性能的影響

Tripathi等研究表明, 豬飼糧中添加含GS為1.3~2.8μmol/g的RSM影響采食量, 可能是因為GS引起的苦澀味降低了飼糧的適口性, 并且GS及其降解產(chǎn)物異硫氰酸酯、噁唑烷硫酮等會引起甲狀腺功能的減退, 進而降低動物的生長性能。研究表明, 通過微生物固態(tài)發(fā)酵RSM飼喂動物, 能夠改善動物生長性能。Ashayerizadeh等分別用50%和100%的RSM和FRSM替代豆粕飼喂肉仔雞, FRSM組的體增重和飼料轉(zhuǎn)化率相比于RSM組均顯著提高, 死亡率顯著降低。Chiang等在基礎飼糧中添加10%FRSM飼喂肉雞, 其ADG比添加10%RSM顯著升高, ADFI和飼料轉(zhuǎn)化率有所提高。本研究結(jié)果表明, Ⅲ、Ⅳ組的ADFI、ADG和F/G與對照組差異不顯著, ADFI、ADG相比于Ⅱ組均有所提高, F/G有所下降, 與上述研究結(jié)果類似。這說明本研究通過微生物固態(tài)發(fā)酵RSM, 基本消除了抗營養(yǎng)因子的不良影響, 一定程度上改善了生長豬的生長性能, 并且提高RSM在生長豬飼糧中的添加量, 使FRSM用量提高為16%, 即RSM的用量為11.2%。

3.2 FRSM替代豆粕對生長豬血清生化指標的影響

血清生化指標能夠綜合反映動物機體的新陳代謝狀況。血清中GLU含量是動物機體內(nèi)能量平衡的重要指標, GLU含量的高低反映了消化吸收作用的增強或減弱。本研究結(jié)果表明, Ⅱ組血清中GLU的含量相比于其他各組均有所降低, 但各組差異不顯著。膽固醇穩(wěn)態(tài)是通過調(diào)節(jié)膽固醇攝取、膽固醇生物合成、膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化和膽汁酸的排泄來實現(xiàn)的。血清膽固醇含量是飲食中膽固醇 (外源性膽固醇) 和從頭合成膽固醇 (內(nèi)源性膽固醇) 的結(jié)果。本試驗結(jié)果表明, Ⅲ、Ⅳ組血清中T-CHOL的含量較Ⅰ、Ⅱ組顯著降低, 可能是因為本研究通過微生物發(fā)酵提高了腸道內(nèi)益生菌的濃度, 益生菌定植在腸道發(fā)酵食物中難消化的碳水化合物, 產(chǎn)生短鏈脂肪酸, 其中丙酸會抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A (HMG-CoA) 還原酶的活性, 而HMG-CoA還原酶又是膽固醇合成的限速酶, 因而起到抑制肝臟膽固醇合成或使膽固醇在血漿和肝臟中再分配, 降低血清膽固醇含量的作用。另外, 本研究發(fā)酵所用短乳桿菌具有較高的膽鹽水解酶活性, De Smet等用具有膽鹽水解酶活性的短乳桿菌飼喂高膽固醇飲食的豬, 發(fā)現(xiàn)其血清中T-CHOL和低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C) 含量與對照組相比顯著降低, 并且其糞便中總膽汁酸的排泄量也明顯增加。這可能是因為膽鹽水解酶能夠降解膽酸鹽, 使腸道內(nèi)的膽鹽被解離后, 溶解度降低, 不易被腸道回收, 促進體內(nèi)膽汁酸向體外排泄, 機體為了彌補肝腸循環(huán)中膽汁酸的不足, 肝臟會利用血液中的膽固醇重新合成新的膽汁酸, 從而降低血清中膽固醇含量。Ⅲ、Ⅳ組血清中TP的含量比Ⅰ、Ⅱ組升高, UN含量下降, 可能是因為發(fā)酵RSM的益生菌可以利用蛋白質(zhì)代謝過程中產(chǎn)生的非蛋白氮作為氮源合成菌體蛋白被動物吸收利用, 提高了氮的利用率, 并減少了糞氮的排放, 從而提高了TP的含量。而UN作為蛋白質(zhì)、氨基酸代謝的終產(chǎn)物, 當氨基酸平衡良好時, UN含量下降 這與Hu等在基礎飼糧中添加9.41%FRSM飼喂肉仔雞, 其血清TP含量顯著升高, 血清UN含量顯著降低的結(jié)果一致。甲狀腺激素是人和動物生長發(fā)育必不可少的內(nèi)分泌激素。金邦荃等用高RSM飼糧飼喂豬, 其甲狀腺明顯腫大, 血清中T₄的含量相比于對照組顯著升高, T₄/T₃異常。Mawson等用含高GS的RSM飼喂豬, 其甲狀腺腫大, 血清T₃和T₄含量升高。本研究結(jié)果表明, Ⅱ組血清中T₄的含量相比于Ⅳ組顯著升高, 血清T₃的含量相比于其他3組極顯著升高, 與上述結(jié)果類似。這可能是因為RSM中抗營養(yǎng)因子GS的降解產(chǎn)物硫氰酸鹽陰離子是碘的競爭者, 通過主動轉(zhuǎn)運穿過細胞膜結(jié)合到甲狀腺球蛋白的酪氨酸殘基上, 阻礙甲狀腺對碘的吸收, 干擾甲狀腺球蛋白分解, 引起T₃和T₄分泌異常, 誘發(fā)缺碘性甲狀腺功能亢進。Anke等以RSM為基礎飼糧飼喂生長豬, 飼糧中補充碘 (1 mg/kg) 降低了硫氰酸鹽陰離子對甲狀腺的影響, 從而改善了生長豬的生長性能。本研究結(jié)果表明, Ⅲ、Ⅳ組血清中T₃和T₄含量與Ⅰ組差異不顯著, 這與Xu等分別用33%、67%和100%的FRSM替代豆粕飼喂肉鴨, 其血清T₃和T₄的含量與對照組沒有顯著差異的報道一致, 說明通過微生物發(fā)酵有效降低異硫氰酸酯的含量, 緩解了甲狀腺功能亢進。

3.3 FRSM替代豆粕對生長豬抗氧化能力的影響

機體的抗氧化酶體系 (如SOD、GSH-Px、T-AOC等) 可在不同水平上清除體內(nèi)多余的自由基, 恢復機體正常的細胞代謝和功能。MDA是脂質(zhì)過氧化作用的終產(chǎn)物, 測定血清中MDA含量能直接反映細胞膜被氧化的程度, 血清MDA含量顯著升高意味著機體自由基增多, 細胞受損程度增強。Hu等在肉仔雞試驗上的結(jié)果表明, FRSM組相比于RSM組提高了血清T-AOC和SOD活性, 降低了MDA的含量, 這與本研究Ⅲ、Ⅳ組血清中SOD的活性高于Ⅰ、Ⅱ組, 且MDA的含量低于Ⅰ、Ⅱ組的結(jié)果一致。本研究通過微生物固態(tài)發(fā)酵RSM, 其水溶性蛋白和酸溶性蛋白含量相比于RSM分別提高了52.88%和44.40%, 而酸溶性蛋白主要由游離氨基酸和小肽組成。有研究表明, 通過固態(tài)發(fā)酵RSM會產(chǎn)生具有較強還原力的小肽, 這些小肽對羥基自由基 (·OH) 和二苯基苦基苯肼 (DPPH) 自由基清除能力較強, 而且小肽的分子質(zhì)量越小, 其清除自由基的能力越強, 即抗氧化活性越強。

3.4 FRSM替代豆粕對生長豬免疫功能的影響

血液中的IgG、IgA和IgM含量的高低直接反映了動物機體全身的體液免疫狀況。TNF-α是由內(nèi)毒素激活的巨噬細胞和淋巴細胞等分泌的一種多活性的細胞因子, 是機體免疫防護的重要介質(zhì), 正常水平的TNF-α可以調(diào)節(jié)免疫應答、抗感染、促進組織修復、引起腫瘤細胞凋亡等。吳東等用FRSM等氮替代7.5%豆粕, 生長豬血清中IgA、IgG和白細胞介素 (IL) -2的含量顯著升高, IgM、IL-1、IL-6和TNF-α含量無顯著影響。王尚榮在基礎飼糧中添加4%、6%和8%FRSM飼喂櫻桃谷鴨, 45日齡時血清中IgG、IgA、IgM含量均比對照組略有提高, 但差異不顯著, 60日齡時添加8%FRSM血清中IgG、IgA、IgM含量相比于對照組均顯著升高。本研究結(jié)果表明, 各組血清中IgA、IgG、IgM的含量差異不顯著, Ⅳ組血清中TNF-α的含量相比于Ⅲ組顯著降低, 但與Ⅰ、Ⅱ組差異不顯著, 說明Ⅳ組免疫功能沒有受到負面影響。