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近年來, 隨著人們對飼用抗生素帶來的負面效應的認識愈加深入, 我國在養(yǎng)殖業(yè)中規(guī)定允許使用的飼用抗生素的種類越來越少, 并且, 禁用飼用抗生素已是大勢所趨。因此, 研發(fā)飼用抗生素的替代品成為動物營養(yǎng)領域的一個研究熱點。發(fā)酵飼料作為一類新型、綠色、環(huán)保的飼料, 由于其在生產(chǎn)過程中微生物發(fā)酵可以產(chǎn)生大量有益于動物健康的代謝產(chǎn)物, 因而其可以在一定程度上減少養(yǎng)殖過程中飼用抗生素的使用, 從而降低養(yǎng)殖成本。因此, 在畜牧生產(chǎn)中, 發(fā)酵飼料的研發(fā)與推廣備受關注。近年來, 諸多研究顯示, 在動物生產(chǎn)中使用發(fā)酵飼料可維持動物消化道微生態(tài)平衡、增強動物的免疫力、提高生長性能。然而, 當前有關發(fā)酵飼料在豬生產(chǎn)中的研究仍主要集中于發(fā)酵飼料對豬生長性能等表型指標的影響, 關于發(fā)酵飼料對豬機體整體代謝影響的報道極少, 對豬肉品質的影響仍不十分清楚。因此, 本試驗擬采用基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質譜的代謝組學技術, 研究發(fā)酵飼料對生長育肥豬血清代謝產(chǎn)物的影響, 同時探討飼喂發(fā)酵飼料對育肥豬生長性能、胴體性狀、肉品質、血清生化指標的影響, 擬為發(fā)酵飼料在豬生產(chǎn)中的合理應用提供相關試驗數(shù)據(jù)。

1.1 試驗動物、試驗飼糧與試驗設計

試驗選用健康、日齡基本一致, 體重約60 kg的三元雜交豬24頭, 隨機分為2組, 分別為基礎飼糧組 (對照組) 和發(fā)酵飼料組 (試驗組) , 每組4個重復, 每個重復3頭豬。對照組飼喂基礎飼糧, 試驗組飼喂80%基礎飼糧和20%發(fā)酵飼料 (發(fā)酵飼料底物組成同基礎飼糧) ?；A飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

發(fā)酵飼料的制作程序如下:采用南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院消化道微生物實驗室保存的唾液乳桿菌L79、枯草芽孢桿菌B1121和釀酒酵母菌S1145制備菌液, 并按照質量比2∶2∶1進行混合 (復合菌總數(shù)量約為1×10⁹CFU/g) , 取對照組基礎飼糧, 按0.2%復合菌液添加于飼糧中, 混合均勻后分裝至發(fā)酵袋中, 于37℃發(fā)酵2 d, 飼喂前再與基礎飼糧以1∶4的比例混合, 將混合后的飼料作為試驗組飼糧。試驗期間, 每日飼喂2次, 自由采食, 自由飲水。預試期6 d, 正試期29 d。

1.2 樣品采集

正式試驗開始后第30天, 將試驗豬禁飼12 h后稱重, 禁飼期間自由飲水。隨后, 每個重復隨機選取1頭豬, 頸靜脈采血, 室溫放置20 min后3 000 r/min離心10 min分離血清, -20℃保存;每組選取4頭接近平均體質量的豬, 按照常規(guī)流程進行屠宰, 檢驗檢疫后測定胴體性狀指標, 并取200 g左右的背最長肌樣品, 存于4℃冰盒中, 用于肉品質測定。

1.3 檢測指標

1.3.1 生長性能和胴體性狀指標測定

試驗開始和結束時對試驗豬進行稱重, 記錄試驗豬的采食量, 計算平均日采食量、平均日增重和料重比。

參照NY/T 825—2004《瘦肉型豬胴體性狀測定技術規(guī)范》測定育肥豬胴體重、屠宰率、背膘厚。

1.3.2 背最長肌肉品質指標測定

背最長肌pH_{45 min}、pH_24 h、亮度 (L*) 值、紅度 (a*) 值、黃度 (b*) 值、滴水損失、蒸煮損失和剪切力的測定參照NY/T 2793—2015《肉的食用品質客觀評價方法》。按照美版NPPC比色板進行肉色評分和大理石紋評分。

1.3.3 背最長肌營養(yǎng)成分測定

利用凱氏定氮法和索氏提取法測定背最長肌樣品中粗蛋白質、粗脂肪、干物質含量。

1.3.4 血清生化指標測定

采用南京生物工程研究所試劑盒測定育肥豬血清總蛋白 (TP) 、尿素氮 (UN) 、甘油三酯 (TG) 、總膽固醇 (TC) 、葡萄糖 (GLU) 含量及谷丙轉氨酶 (ALT) 、谷草轉氨酶 (AST) 活性。

1.3.5 血清代謝產(chǎn)物組成測定

取100μL血清置于1.5 mL離心管中, 加0.3 mL甲醇, 10μL內(nèi)標 (2-氯苯丙氨酸) , 渦旋30 s, 在4℃、12 000 r/min離心10 min, 移取200μL上清, 轉入自動進樣瓶。采用基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質譜的代謝組學技術, 對血清進行色譜分離和鑒定, 并測定標志性差異代謝產(chǎn)物含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Waters Masslynx V4.1軟件對原始數(shù)據(jù)進行峰檢測和峰匹配。每個樣本的總峰面積歸一化至10000。采用有監(jiān)督的偏最小二乘判別分析 (partial least-square discriminant analysis, PLS-DA) 方法對樣品進行模式識別分析。潛在標志物根據(jù)變異權重參數(shù)值 (VIP) 、置信區(qū)間得分圖 (scoring plot) 和載荷圖 (loading plot) 進行篩選, 用SPSS20.0進行獨立樣品t檢驗 (independent-sample t test) 方法分析, 再根據(jù)VIP和統(tǒng)計結果進行判別分析。血清生化指標等數(shù)據(jù)以平均值和標準誤的形式表示, 試驗所得數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010初步處理后, 采用SPSS 20.0軟件中的獨立樣本t檢驗方法進行分析, P<0.05為達到顯著性水平。

2結 果

2.1 發(fā)酵飼料中營養(yǎng)成分的變化

由表2可知, 發(fā)酵飼料中粗蛋白質、粗纖維含量及干物質消失率高于基礎飼糧 (P>0.05) , 粗脂肪含量低于基礎飼糧 (P>0.05) 。

本試驗期間, 2組育肥豬的生長性能和胴體性狀雖無顯著差異, 但飼喂發(fā)酵飼料的試驗組育肥豬的料重比在數(shù)據(jù)上低于對照組, 宰前活重、胴體重、屠宰率、眼肌面積在數(shù)據(jù)上均高于對照組, 并且背膘厚較低。導致該結果的原因可能是與試驗豬處于生長發(fā)育后期有關, 此時, 育肥豬采食量大, 外源添加物難以在短時間內(nèi)有效地改變其生長速度, 此外, 本研究所用豬的數(shù)量相對較少。因此, 有關發(fā)酵飼料對豬的生長性能的影響還需進一步研究。

動物血清生化指標可反映動物的生理代謝和健康情況。血清中的總蛋白在維持血管內(nèi)膠體滲透壓、運輸養(yǎng)分等功能中具有重要的作用, 可反映機體本身的營養(yǎng)狀況和對蛋白質的消化吸收情況。血清中的總蛋白含量越高, 表明機體合成蛋白質的能力越強。本試驗中, 試驗組育肥豬血清中總蛋白含量顯著高于對照組, 說明豬的蛋白質合成能力增強。尿素氮是機體蛋白質和氨基酸等組分的代謝產(chǎn)物, 其含量可相對準確地反映出動物體內(nèi)蛋白質代謝和氨基酸代謝的平衡。本試驗中, 試驗組育肥豬血清中尿素氮含量顯著高于對照組, 說明飼喂發(fā)酵飼料促進機體蛋白質的分解代謝。由此, 基于飼喂發(fā)酵飼料組育肥豬血清中總蛋白和尿素氮含量皆高于對照組, 本試驗認為發(fā)酵飼料可能促進了機體蛋白質整體代謝, 這也可能是2組豬的生長性能沒體現(xiàn)出差異的原因之一。

本研究利用代謝組學研究手段, 研究發(fā)現(xiàn)飼喂發(fā)酵飼料顯著影響了育肥豬血清中L-焦谷氨酸、黃嘌呤、丁子香酚、丙烯酰胺和對-香豆酸含量。在這些代謝產(chǎn)物中, L-焦谷氨酸是谷胱甘肽的分解產(chǎn)物之一, 血清中L-焦谷氨酸含量下降, 說明飼喂發(fā)酵飼料可在一定程度上降低谷胱甘肽的分解代謝, 此結論與前文所述發(fā)酵飼料可增強育肥豬機體蛋白質整體代謝這一結論相符。研究發(fā)現(xiàn), 谷胱甘肽可減少蛋白巰基被氧化導致的酶失活, 并可與體內(nèi)自由基結合加速其向酸類物質的還原過程, 因而其可減輕自由基對機體重要臟器的損傷。由此, 谷胱甘肽分解代謝減弱對維持機體健康有著積極作用。本試驗中育肥豬血清代謝產(chǎn)物中的對-香豆酸與丁子香酚主要來自于微生物發(fā)酵飼料生成, 與對照組相比, 其在試驗組的育肥豬血清中含量升高, 原因可能與飼料發(fā)酵生成有關。相關研究表明, 對-香豆酸與丁子香酚均具有良好的抗氧化活性, 上述物質含量上升暗示發(fā)酵飼料具有增強育肥豬抗氧化應激的作用。本研究中, 飼喂發(fā)酵飼料的育肥豬血清中的丙烯酰胺和黃嘌呤含量上升, 出現(xiàn)該結果的具體原因尚不清楚。

肉色是影響豬肉感官的重要指標。研究表明, 飼喂發(fā)酵飼料可使豬肉肉色更加鮮艷。本試驗中, 試驗組育肥豬背最長肌a*值、肉色評分顯著高于對照組, 原因可能與試驗組育肥豬血清中的對-香豆酸、丁子香酚含量增多和機體谷胱甘肽代謝降低有關。如前所述, 對-香豆酸與丁子香酚具有抗氧化活性, 能夠抑制細胞膜脂質的過氧化反應, 從而延緩肌肉中肌紅蛋白被氧化為導致肉色變暗的高鐵血紅蛋白。因此試驗組的育肥豬血清中對-香豆酸與丁子香酚含量升高, 暗示發(fā)酵飼料具有提高肉的色澤和亮度及改善肉色的功能。嫩度是豬肉口感的重要物理指標, 是豬肉質地的反映, 而剪切力是評定肌肉嫩度的客觀指標, 其平均剪切力越高, 肉越老。有研究表明, 嫩度與豬背最長肌內(nèi)脂肪含量和肉的保水量相關, 肉的保水性增加可減少汁液損失, 從而提高嫩度。相關研究表明, 育肥豬飼糧中添加發(fā)酵飼料可有效改善豬肉品質, 提高肌內(nèi)脂肪含量, 顯著降低背最長肌的剪切力值。本試驗結果顯示, 試驗組育肥豬背最長肌中脂肪含量顯著高于對照組, 且蒸煮損失低于對照組, 剪切力也顯著低于對照組, 結果也與上述文獻報道相符。造成上述結果的原因可能是飼喂發(fā)酵飼料增強了機體抗氧化能力, 進而增強了機體的抗應激能力, 從而使屠宰后背最長肌細胞中糖酵解速度減慢, 進而導致其pH下降速度顯著慢于對照組。研究顯示, 較慢的pH下降速度可降低肌紅蛋白、肌動蛋白等蛋白質的變性程度, 從而使肌肉色澤更加鮮艷、嫩度提升、系水力增強, 該結果也暗示發(fā)酵飼料可能具有改善肌肉的食用品質的功能。