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導(dǎo)讀

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為山東省2016年9月刈割新鮮全株玉米，營(yíng)養(yǎng)成分含量[干物質(zhì)(DM)基礎(chǔ)]：有機(jī)物(OM)86.84％ ，粗蛋白質(zhì)(CP)8.27％ ，中性洗滌纖維(NDF)55.95％，酸性洗滌纖維(ADF)26.03％。青貯袋(75cm x 40cm x 8cm)分內(nèi)外2層，外層為聚丙烯材料，內(nèi)層為聚乙烯材料。乳酸菌制劑(11GFT，加拿大Pioneer Hi-Bred公司)，每克產(chǎn)品含有1.1×10¹¹CFU乳酸菌，包括布氏乳桿菌和干酪乳桿菌2種。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取籽粒處于蠟熟期的新鮮全株玉米720 kg，品種為登海605，外觀(guān)呈綠色，含水量為73.67％，切短至1～4 cm，平均分為4組，每組12個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15 kg。對(duì)照組每個(gè)重復(fù)噴霧添加45 mL去離子水，試驗(yàn)組分別噴霧添加2、10和20 mg/kg的乳酸菌制劑(預(yù)先稀釋于45 mL去離子水中)，分別混合均勻。然后將全株玉米青貯快速裝填并壓實(shí)于青貯袋中，置于室溫條件下密封保存，試驗(yàn)期60 d。

1.3 樣品采集及指標(biāo)測(cè)定

于第45和60天分別開(kāi)袋取樣，每組取樣6個(gè)重復(fù)，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.1 感官評(píng)價(jià)指標(biāo)

按照德國(guó)農(nóng)業(yè)協(xié)會(huì)(DLG)青貯質(zhì)量感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定，根據(jù)青貯的氣味(14分)、結(jié)構(gòu)(4分)、色澤(2分)進(jìn)行評(píng)分。綜合3項(xiàng)得分，評(píng)定為優(yōu)(16～20分)、可(10～15分)、中(5～9分)、下(0~4分)4個(gè)等級(jí)。

1.3.2 微生物數(shù)量

取新鮮樣本30 g，加入到盛有270 mL生理鹽水的塑料袋或樣品瓶中，充分?jǐn)嚢韬髮⒋巳芤合♂?0～10⁷倍數(shù)。微生物數(shù)量測(cè)定采用平板計(jì)數(shù)法，乳酸菌用MRS瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)，稱(chēng)取64.25 g MRS培養(yǎng)基于1L蒸餾水中，加熱煮沸溶解后置于121℃高壓滅菌15 min，傾注平板備用。取100μL不同濃度的接種液分別接種于平板上，涂勻后置于厭氧培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)2 d，分別對(duì)平板上的乳酸菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。霉菌采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)，稱(chēng)取40.1 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基于1 L蒸餾水中，加熱煮沸溶解后置于121 ℃高壓滅菌20 min，傾注平板后備用。取100 μL不同濃度的接種液分別接種于平板上，涂勻后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 d分別進(jìn)行計(jì)數(shù)(每個(gè)平板上菌落數(shù)控制在30～300個(gè)之間為有效)。

1.3.3 pH測(cè)定

取10 g新鮮樣本，加入90 mL去離子水，4℃浸提24 h，采用pH計(jì)(HI9025，意大利Hanna In-struments公司)測(cè)定濾液pH。

1.3.4 有機(jī)酸及氨態(tài)氮含量測(cè)定

取35 g新鮮樣本，放入100 mL的廣口三角瓶中，加人70 mL去離子水，4℃浸提24 h，然后通過(guò)2層紗布和定性濾紙過(guò)濾，所得的液體為青貯浸提液，置于-20℃條件下保存待測(cè)。濾液用來(lái)測(cè)定乳酸(LA)、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)和氨態(tài)氮(NH₃ -N)含量。乳酸含量采用對(duì)羥基聯(lián)苯法測(cè)定 ，以乳酸鈣為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算乳酸含量，結(jié)果以g/kg DM 計(jì)。揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量采用高效氣相色譜儀(GC-2010，日本島津公司)進(jìn)行測(cè)定 ，包括乙酸、丙酸和丁酸含量，結(jié)果以g/kg DM計(jì)。氨態(tài)氮含量采用苯酚一次氯酸鈉比色法進(jìn)行測(cè)定，以氯化銨為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算氨態(tài)氮含量，結(jié)果以g/kg TN(總氮)計(jì)。

1.3.5 化學(xué)成分測(cè)定

取新鮮全株玉米青貯制備風(fēng)干樣本，按照AOAC(2015)中的方法測(cè)定OM、CP、NDF及ADF含量。水溶性碳水化合物(water.soluble carbohydrate，WSC)含量采用蒽酮硫酸比色法測(cè)定 ，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算WSC含量，結(jié)果以g/kg DM計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步整理后，采用SPSS16.0軟件中的單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用Duncan氏多重比較檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值(mean)和均方根誤差(SEM)表示，P<0.05為差異顯著。

2.1 乳酸菌制劑對(duì)全株玉米青貯感官評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響

由表1可見(jiàn)，各組全株玉米青貯氣味、結(jié)構(gòu)、色澤及綜合評(píng)分均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.2 乳酸菌制劑對(duì)全株玉米青貯微生物數(shù)量的影響

由表2可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，2、10和20 mg/kg組45 d的乳酸菌數(shù)量分別提高了24.54％ 、25.96％和25.11％，差異均顯著(P<0.05)，霉菌數(shù)量分別降低了10.09％(P>0.05)、20.00％(P<0.05)和14.13％(P>0.05)；2、10和20 mg/kg組60 d的乳酸菌數(shù)量分別提高17.44％ 、20.93％和20.54％ ，差異均顯著(P<0.05)，霉菌數(shù)量分別降低31.01％、29.65％和28.29％ ，差異均顯著(P<0.05)。

3.1 乳酸茵制劑對(duì)全株玉米青貯品質(zhì)的影響

青貯的基本原理是利用好氣性微生物和植物細(xì)胞本身的呼吸作用使青貯窖內(nèi)盡快形成厭氧環(huán)境，然后在密閉厭氧條件下利用乳酸菌的活動(dòng)，產(chǎn)生乳酸，抑制其他腐敗微生物的活動(dòng)，達(dá)到飼料長(zhǎng)期保存及使用的目的，一般包括好氧細(xì)菌活動(dòng)階段，乳酸菌發(fā)酵階段和發(fā)酵穩(wěn)定階段等。本研究表明，各組全株玉米青貯感官評(píng)價(jià)綜合評(píng)分均在16～20分，達(dá)到優(yōu)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明各組青貯效果均較好。微生物數(shù)量方面，添加乳酸菌制劑組的乳酸菌數(shù)量顯著提高，霉菌數(shù)量均有不同程度降低，這與前人研究結(jié)果類(lèi)似 ，說(shuō)明添加乳酸菌制劑可以促使乳酸菌成為青貯過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌群，縮短好氧細(xì)菌活動(dòng)階段，對(duì)霉菌等有害微生物產(chǎn)生抑制作用。有機(jī)酸含量分析結(jié)果表明，添加乳酸菌制劑可提高發(fā)酵45 d乳酸含量，表明添加乳酸菌制劑可以提高青貯早期乳酸生成量，改善青貯品質(zhì)。但各組發(fā)酵60 d乳酸含量無(wú)顯著差異，且60 d乳酸含量較45 d降低。分析原因?yàn)楸驹囼?yàn)采用的乳酸菌制劑為布氏乳桿菌和干酪乳桿菌混合劑，其中布氏乳桿菌屬異型發(fā)酵乳酸菌，能分解乳酸產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸如乙酸等。Kung等將3種劑量(1x10⁵ 、5x10⁵、1x10⁶  CFU/g)布氏乳桿菌接種于紫花苜蓿中發(fā)酵56 d，結(jié)果表明乳酸含量不同程度降低，乙酸含量升高。呂文龍等  將布氏乳桿菌接種于青玉米秸進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)低劑量布氏乳桿菌可以一定程度上提高乳酸生成量，但隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)及劑量的提高，乳酸含量顯著降低，乙酸含量顯著升高。干酪乳桿菌屬乳桿菌屬，兼性異型發(fā)酵乳糖。Nishino等報(bào)道，將干酪乳桿菌接種于全株玉米(2x10⁶ CFU/g)和全混合日糧(3×10⁶ CFU/g)發(fā)酵60 d后，乳酸含量提高，乙酸含量顯著降低。隨后，Nishino等在羊茅草、全株玉米及全混合 日糧中分別接種干酪乳桿菌，發(fā)酵60 d，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)乳酸含量提高，乙酸含量降低。表明干酪乳桿菌可以提高青貯乳酸生成量、降低乙酸生成量。因此，本研究觀(guān)測(cè)到的45 d試驗(yàn)組乳酸含量的升高可能與干酪乳桿菌的早期定植并發(fā)酵產(chǎn)生乳酸有關(guān)。但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，布氏乳桿菌可在后期大量繁殖 ，可能利用了干酪乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸，導(dǎo)致60 d乳酸含量較45 d降低。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組乙酸含量較對(duì)照組有不同程度提高，且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乙酸含量繼續(xù)升高。據(jù)報(bào)道，布氏乳桿菌在發(fā)酵過(guò)程中能將乳酸分解成乙酸和丙二醇，而相對(duì)乳酸而言，乙酸等揮發(fā)性脂肪酸是一種更有效的抗真菌及霉菌的酸類(lèi)物質(zhì)，因此更有利于提高青貯的有氧穩(wěn)定性。綜上，本研究發(fā)現(xiàn)的乳酸、乙酸含量的變化可能是布氏乳桿菌和干酪乳桿菌共同作用的結(jié)果。丁酸是由腐敗菌和酪酸菌分別分解蛋白質(zhì)、葡萄糖和乳酸而生成的產(chǎn)物，其含量的高低反映青貯飼料品質(zhì)的優(yōu)劣，丁酸含量越多，青貯品質(zhì)越差。本研究發(fā)現(xiàn)添加乳酸菌制劑可以降低45 d青貯的丁酸含量，這與霉菌等腐敗菌數(shù)量的降低相符合。

3.2 乳酸菌制劑對(duì)全株玉米青貯營(yíng)養(yǎng)成分的影響

全株玉米青貯的營(yíng)養(yǎng)成分是評(píng)價(jià)青貯質(zhì)量好壞的另一項(xiàng)重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，添加乳酸菌制劑可以一定程度上提高全株玉米青貯的CP含量，降低其中氨態(tài)氮的比例。青貯飼料中氨態(tài)氮主要由植物酶對(duì)蛋白質(zhì)的降解和微生物分解利用蛋白質(zhì)和氨基酸產(chǎn)生，總氮中氨態(tài)氮含量反映了青貯飼料蛋白質(zhì)降解的程度 。Nishino等將布氏乳桿菌、干酪乳桿菌分別接種于羊茅草和全混合日糧中進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果表明氨態(tài)氮含量均顯著降低。Li等 報(bào)道，在玉米秸稈中接種復(fù)合乳酸菌制劑發(fā)酵150 d后，總氮中氨態(tài)氮含量較對(duì)照組顯著降低，CP含量顯著提高。上述試驗(yàn)結(jié)果均與本研究類(lèi)似，推測(cè)乳酸菌可能通過(guò)降低全株玉米在儲(chǔ)存過(guò)程中蛋白質(zhì)的降解作用或抑制腐敗微生物的分解作用，從而降低總氮中氨態(tài)氮含量，間接提高CP含量，提高了其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。此外，研究還發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組NDF含量不同程度升高，WSC含量降低，這與Addah等的研究結(jié)果類(lèi)似。玉米秸稈中含有較為豐富的WSC，為乳酸菌的定植提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此乳酸菌的加入可能利用了秸稈中的WSC，使得細(xì)胞壁中難以降解的碳水化合物如NDF等組分有所升高。

綜合各營(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管試驗(yàn)組CP含量較對(duì)照組提高，但各組OM含量差異并不顯著，說(shuō)明試驗(yàn)組全株玉米青貯的無(wú)氮化合物含量存在一定程度降低，這可能與乳酸菌利用了全株玉米青貯的可溶性碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖有關(guān)，乳酸菌的生長(zhǎng)抑制了因腐敗微生物作用引起的蛋白質(zhì)的降解，從而使青貯品質(zhì)維持在較高水平。這也與本研究觀(guān)測(cè)到的發(fā)酵60 d全株玉米青貯的OM和WSC含量較45 d降低，而CP含量基本不變的結(jié)果相吻合。