凝結芽孢桿菌的研究
益生菌凝結芽孢桿菌是近年來國內外學者的研究熱點。凝結芽孢桿菌具有與乳酸桿菌、雙歧桿菌一樣的調節(jié)腸道內菌群平衡、促進營養(yǎng)物質代謝和利用、提高免疫力等保健特性,凝結芽孢桿菌形成的芽孢具有耐高溫、耐酸和耐膽鹽等高抗逆性特點。凝結芽孢桿菌作為新型微生態(tài)制劑,在畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、醫(yī)藥、保健和食品行業(yè)被廣泛應用。作者在此簡單概述凝結芽孢桿菌的理化性質以及在工業(yè)生產(chǎn)、養(yǎng)殖業(yè)以及臨床等方面的應用進展。
1凝結芽孢桿菌的理化性質
凝結芽孢桿菌為芽孢桿菌屬革蘭氏陽性桿菌,端生芽孢,表面無鞭毛,多數(shù)菌兩端鈍圓,少數(shù)菌為短鏈狀。凝結芽孢桿菌的最適生長pH值為6.6~7.0,最適生長溫度為45~50 ℃,可以分解糖類生成L-乳酸,為同型乳酸發(fā)酵菌。凝結芽孢桿菌具有產(chǎn)L-乳酸、生成芽孢、兼性厭氧、耐酸等生理生化特征,經(jīng)口服進入到腸胃后,具有益生保健特性。產(chǎn)L-乳酸特征,使得腸道中的雙歧桿菌等利用乳酸的有益菌能更好地生長與繁殖。生成芽孢特征,可以更好地恢復胃腸道的微生態(tài)平衡,且所產(chǎn)芽孢使得凝結芽孢桿菌能夠耐受胃液的低pH值環(huán)境。兼性厭氧特征,使得凝結芽孢桿菌適宜在人體消化系統(tǒng)尤其是腸道等低氧環(huán)境下生長。耐酸特征,則保證了凝結芽孢桿菌有85%的概率通過胃液在腸 道存活生長。但是由于凝結芽孢桿菌沒有鞭毛,導致其粘附性較弱,無法在腸道中長期存活。凝結芽孢桿菌在腸道中還會分泌大量有益物質,如淀粉酶、蛋白酶、B族維生素、氨基酸、短鏈脂肪酸和凝固素等,這些物質不僅有利于腸道消化吸收還能抑制有害細菌。特別是凝固素,在60℃、pH值4~8的條件下處理90min仍保持生物活性,且不受淀粉酶、酯酶和有機溶劑的影響。因此,凝結芽孢桿菌對胃腸道炎癥有一定的治療作用。
凝結芽孢桿菌還具有很強的抗逆性,在高溫、高滲和酸性環(huán)境下均保持較高的存活率,能有效穿過胃液環(huán)境(強酸和消化酶),在腸道生長,并發(fā)揮益生作用。但在酸性環(huán)境中,凝結芽孢桿菌對熱耐受性下降。
2凝結芽孢桿菌在工業(yè)領域的應用
2.1 生產(chǎn)乳酸
乳酸及其衍生物作為重要的有機化工原料和精細化學品被廣泛應用。凝結芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸具有轉化率高、能耗少等特點,原料價廉、來源廣,所產(chǎn)乳酸具有較高的光學純度?,F(xiàn)階段國際上乳酸幾乎全部是通過微生物發(fā)酵來生產(chǎn)的。目前,對芽孢桿菌屬細菌的研究主要以自然篩選和傳統(tǒng)誘變選育為主。Yadav等報道了一系列產(chǎn)乳酸菌株,其中便有凝結芽孢桿菌??道蚴紫炔捎酶咤i酸鉀-溴化鉀平板法初篩出高產(chǎn)乳酸的凝結芽孢桿菌菌株,然后通過紫外-氯化鋰復合誘變進行復篩,為了進一步提高殘留總糖的消耗速率,在發(fā)酵過程中又采用光敏試劑8-甲氧補骨脂素對菌株進行誘變處理,使得誘變后的菌株消耗麥芽二糖的能力提高了21.3%,乳酸產(chǎn)量最高達到64.8g·L-1。馬瑞通過單因素實驗和Plackett-Burman實驗篩選出凝結芽孢桿菌S44,并對其發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸條件進行了優(yōu)化,結果發(fā)現(xiàn),在優(yōu)化條件下,發(fā)酵72h,85g·L-1葡萄糖即消耗完畢,乳酸產(chǎn)量提高了25.2%,由優(yōu)化前的59.09g·L-1提高到73.95g·L-1,糖酸轉化率為86.75%,糖利用率為100%。謝月嬌用PEG酶水解玉米秸稈中的木質纖維素得到葡萄糖,葡萄糖得率為81.11%,酶解率為87.01%;然 后 利 用 酶 解 上 清 液 進行凝結芽孢桿菌 LA204發(fā)酵產(chǎn)乳酸,乳酸最終濃度為84.49g.L-1,秸稈轉化率達到0.56g·g-1,基本實現(xiàn)秸稈纖維素和半纖維素的有效利用。Ong等利用凝結芽孢桿菌 WCP10-4發(fā)酵纖維二糖產(chǎn)L-乳酸,200g·L-1的纖維二糖以97.8%的轉化率和7.01g·L-1·h-1的產(chǎn)酸速率轉化成了196.3g·L-1的 L-乳酸。
2002年,盧濤等從西藏當雄溫泉附近的土壤中篩選到一株凝結芽孢桿菌,經(jīng)紫外線和亞硝基胍誘變,獲得一株酶活達到100U.mL-1的突變菌株,較出發(fā)菌株的酶活提高了約25倍,發(fā)酵液經(jīng)90 ℃ 處理60min,相對酶活仍保持在90%以上。Badu等對凝結芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)胞外α-淀粉酶的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)有機氮 源(如蛋白胨和牛肉提取物)利于其產(chǎn)生α-淀粉酶。Medda等對凝結芽孢桿菌 CUMC512所產(chǎn)淀粉酶進行純化,比活力提高72倍,酶產(chǎn)率為49%~52%。
2.3 生產(chǎn)脂肪酶
細菌脂肪酶在生物技術工業(yè)中發(fā)揮著重要作用,如作為洗滌添加劑、催化外消旋化合物動力學分解以及催化酯化反應等。Kanwar等對凝結芽孢桿菌 MTCC-6375的一種新型胞外脂肪酶進行了分離純化,該酶在45℃下暴露20min依然能夠保持100%的酶活。Alkan等通過凝結芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵制備胞外脂肪酶,以甜瓜固體廢棄物為基本營養(yǎng)源,添加1%橄欖油,培養(yǎng)24h,脂肪酶產(chǎn)量達到最高(78069U·g-1)。Gowthami等從土壤樣品中分離得到一株能夠分泌耐高溫脂肪酶的凝結芽孢桿菌,優(yōu)化培養(yǎng)條件后,脂肪酶產(chǎn)量增加3.2倍。
3討 論
近年來我國養(yǎng)豬用抗生素的弊端日益暴露,研發(fā)與推廣安全高效飼料已成為飼料工業(yè)與養(yǎng)豬業(yè)的熱點之一。我國農(nóng)業(yè)部已于2013年12月30日將凝結芽孢桿菌正式列入《飼料添加劑品種名錄 2013》。凝結芽孢桿菌具有乳酸桿菌、雙歧桿菌等腸道主要有益菌的相似益生功能,且具備良好的抗逆性,能夠滿足仔豬等畜禽顆粒飼料的加工需求。蒲俊寧在斷奶仔豬飼糧中添加200~400g·t-1凝結芽孢桿菌制劑,結果發(fā)現(xiàn),仔豬的空腸食糜雙歧桿菌數(shù)量、盲腸食糜雙歧桿菌和芽孢桿菌數(shù)量顯著增加(P<0.05),空腸黏膜claudin-1、occludin基因表達水平明顯 提 高(P<0.05),空腸黏膜mucin2基因mRNA相對表達量也顯著提高(P<0.05),斷奶仔豬飼糧中添加苯甲酸+凝結芽孢桿菌+牛至油顯著降低了仔豬血清TNF-α和IL-1β的含量。楊玲等在仔豬飼糧中添加200mg·kg-1凝結芽孢桿菌,明顯降低了仔豬腹瀉率及仔豬糞便大腸桿菌數(shù) 量。張越 等在斷奶仔豬飼糧中添加凝結芽孢桿菌,然后前腔靜脈采血,分離血漿;屠宰場取腸段制成切片,顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),添加凝結芽孢桿菌可改善仔豬小腸形態(tài)結構,顯著提高仔豬血液白蛋白水平,降低總膽固醇和谷氨酰轉肽酶水平,提高回腸和十二指腸絨毛高度,增大十二指腸絨毛表面積。李永明等研究了飼糧添加凝結芽孢桿菌對母豬及仔豬腸道微生物組成和血清生化指標的影響,結果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,飼糧添加凝結芽孢桿菌有提高母豬糞微生物多樣性指數(shù)的趨勢(P=0.15),顯著提高 Anaeroplasma屬細菌含量(P<0.01),顯著降低Catenibacterium屬細菌含量 (P<0.05),有提高 Butyricicoccus(P<0.1)、Peptoniphilus(P=0.1)和Acetivibrio(P<0.1)屬細菌含量的趨勢,有降低 Helicobacter(P<0.1)、Trabulsiella(P=0.05)、Lachnobacterium(P<0.1)和 Planobacterium(P=0.1)屬細菌含量的趨勢;同時使母豬血清內毒素(ET)含量顯著降低21.3%(P<0.05)、血清免疫球蛋白IgG 含量顯著提高23.3%(P<0.05)、血清觸珠蛋白(HPT)含量顯著降低50%(P<0.01)、主要急性期蛋白(MAP)含量顯著降低34.5%(P<0.05),可見飼糧添加凝結芽孢桿菌可明顯減少母豬腸源性內毒素吸收,減少炎癥反應,增強免疫力,提高母豬健康水平。黃遵錫等發(fā)現(xiàn)飼用凝結芽孢桿菌制劑能夠顯著增加實驗仔豬體重,顯著降低料肉比。
3.2 水產(chǎn)養(yǎng)殖
隨著科技的進步,人民生活水平的提高,水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模逐步擴大,從而引發(fā)養(yǎng)殖環(huán)境惡化、水產(chǎn)疾病頻發(fā)等問題,為解決這些問題,大量使用消毒劑和抗生素,形成了惡性循環(huán)。微生態(tài)制劑具有安全性高、無殘留的特性,有望成為治理水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的利器。凝結芽孢桿菌不僅可促進水產(chǎn)動物消化吸收,降低餌料系數(shù),提高免疫和抗病能力,還可凈化養(yǎng)殖環(huán)境。付天璽等在基礎飼料中分別添加不同劑量的凝結芽孢桿菌均能顯著提高奧尼羅非魚的胃、肝、胰和腸道蛋白酶活性(P<0.05),實驗組的干物質表觀消化率、蛋白質消化率、相對增重率、餌料系數(shù)和蛋白質效率顯著高于對照組(P<0.05)。Ring等發(fā)現(xiàn)凝結芽孢桿菌能夠促進錦鯉的生長,與對照組相比,實驗組錦鯉體重每尾約增加8.3g,存活率提高2.7%。張維娜采用體外抑菌實驗和共培養(yǎng)實驗考察了凝結芽孢桿菌JSSW-07對多種水產(chǎn)病原菌的拮抗作用,結果發(fā)現(xiàn),凝結芽孢 桿菌對溫和氣單胞菌 (Aeromonas sobria)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)具有拮抗作用,能夠抑制其生長,同時還能夠提高堿性磷酸酶、總蛋白、谷草轉氨酶、超氧化物歧化酶、過氧化物酶的水平,提高肝臟抗氧化能力,從而較好促進銀鯽幼魚的生長,提高機 體 免 疫 力。王彥波研 究 發(fā) 現(xiàn),在 飼料中添加適量凝結芽孢桿菌,能夠改善羅非魚肌肉中鈣、磷和粗脂肪的含量并增強其生長性能。趙鈺以凝結芽孢桿菌LL1103為研究對象,發(fā)現(xiàn)粗提抑菌物質lactocinL L1103在各濃度下均能對大黃魚起到抑制腐敗菌生長、延長貨架期的作用。王明陽等發(fā)現(xiàn)添加1×1010CFU·kg-1凝結芽孢桿菌,能 顯 著 提 高對蝦血清溶菌酶、總一氧化氮合酶、誘導性一氧化氮合酶的活性,可見飼糧添加凝結芽孢桿菌可有效促進凡納濱對蝦的生長,提高其血清非特異性免疫水平。
國內對凝結芽孢桿菌在養(yǎng)雞方面的應用研究還處于起步階段,相關報道不多。趙必遷等探究了凝結芽孢桿菌對蛋雞生產(chǎn)性能的影響,采用玉米-豆粕型粉狀飼糧,選取24000只315日齡的羅曼粉殼蛋雞,隨機分成3組,2個實驗組在對照組飼糧基礎上分別添加150mg·kg-1和200mg·kg-1凝結芽孢桿菌,結果顯示,2個實驗組產(chǎn)蛋率 顯著提高 2.02% (P<0.05)和1.57%(P<0.05),破蛋率顯著降低17.25%(P<0.05)和 14.78%(P<0.05),死亡率顯著降低22.58%(P<0.05)和29.03%(P<0.05)。王政等考察了飲水中添加凝結芽孢桿菌對白羽肉雞生產(chǎn)性能、腸道微生物數(shù)量、揮發(fā)性脂肪酸及空腸腸道形態(tài)結構的影響,結果表明,飲水中添加1×106cfu·mL-1的凝結芽孢桿菌能顯著提高白羽肉 雞采食量 (P<0.05),盲腸食糜中乳酸桿菌數(shù)量顯著增加(P<0.05),而大腸桿菌數(shù)量顯著降低(P<0.05),高劑量的凝結芽孢桿菌能夠顯著增加丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸的生成(P<0.05),并增加空腸絨毛高度/隱窩深度。曹廣軍等研究發(fā)現(xiàn),在商品母黃羽雞基礎飼糧中添加不同劑量的凝結芽孢桿菌制劑可提高日均采食量和日均增重量,顯著降低料肉比,同時提高肌肉的pH值,緩解肌肉酸解速度。Wu等研究發(fā)現(xiàn),凝結芽孢桿菌對患有壞死性腸炎的肉雞有顯著療效。
凝結芽孢桿菌作為一種高耐受性的益生菌,可以順利通過人體胃腸道系統(tǒng),調節(jié)腸道菌群異常所引起的疾病,調節(jié)腸道消化功能,作為免疫佐劑提高腸道免疫力?;谀Y芽孢桿菌在宿主腸道中的調節(jié)功能,其在胃腸道疾病臨床治療上具有很好的輔助效果。李躍芝用蒙脫石散與凝結芽孢桿菌活菌片聯(lián)合沙棘干乳劑治療小兒遷延性腹瀉,效果很好。同樣的,張玉梅等用凝結芽孢桿菌活菌片與復方胃蛋白酶顆粒聯(lián)合治療小兒遷延性慢性腹瀉,5d后,以糞便性狀及次數(shù)為評判 標 準,治療有效率達到95%以上,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Majeed等用凝結芽孢桿菌MTCC5856治療腹瀉型腸道易激綜合癥,與對照組的安慰劑相比,90d后服用凝結芽孢桿菌活菌片的患者臨床癥狀顯著改善。孕婦作為特殊群體,臨床用藥往往受到一定的限制。而凝結芽孢桿菌活菌片非常安全,是國家批準的明確寫明孕婦和哺乳期婦女可以使用的益生菌制劑。郭偉男采用常規(guī)靜脈補液療法聯(lián)合凝結芽孢桿菌活菌片治療妊娠劇吐,7d治療有效率為100%,治愈率提高了近2倍,在提高總體療效、提高尿酮體轉陰率、改善患者惡心嘔吐癥狀等方面均較單純靜脈補液效果更好(P<0.05)。凝結芽孢桿菌與其它益生菌相比是唯一具有保水作用的益生菌制劑,可起到保水潤腸的作用,有效消除腹脹便秘等。臨床證明,凝結芽孢桿菌在治療孕婦功能性腹脹、預防剖腹產(chǎn)術后胃腸功能紊亂等方面具有顯著的效果。凝結芽孢桿菌除了對腸道疾病有很好的臨床效果外,對一些細菌病毒等傳染類疾病也有很好的臨床應用效果。凝結芽孢桿菌抑菌物質對革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌均有明顯的抑菌效果,具有廣譜抗菌性。細菌性陰道?。ǎ拢郑┦鞘澜绶秶鷥茸畛R姷年幍栏腥炯膊?,通常使用抗生素治療,但是治療效果不明顯。為了證明凝結芽孢桿菌的輔助治療可以提高抗生素療法的治愈率,Sudha等進行了初步研究:選取40個年齡和患病程度一樣的患者,分成2組,對照 組患者只給予標準抗生素治療,實驗組在抗生素的基礎上輔以凝結芽孢桿菌 UniqueIS-2膠囊,治療90d后,實驗組80%的患者病癥減輕,胺檢測實驗顯示出明顯的陽性反應,而對照組僅45%的患者病癥減輕。手足口病是一種腸道病毒傳染性疾病,多發(fā)于學齡前兒童。熱毒寧注射液聯(lián)合凝結芽孢桿菌活菌片治療手足口病具有很好的治愈率和總有效率。鄧星梅等用熱毒寧注射液聯(lián)合凝結芽孢桿菌活菌片治療手足口病,7d治療總有效率(治愈率和好轉率)為95.24%,治愈率提高了近1倍。
普通凝結芽孢桿菌的耐受性較差,為保證微生態(tài)制劑長期儲存不易失活,制備時必須要考慮熱穩(wěn)定性、耐酸性、耐膽鹽性等一系列問題。為了更好地發(fā)揮凝結芽孢桿菌的益生作用,有必要對其產(chǎn)孢條件進行研究??焖俅罅康匦纬裳挎呤侵苽淠Y芽孢桿菌制劑的關鍵。Sen等采用響應面法對發(fā)酵過程進行建模、優(yōu)化和分析,將凝結芽孢桿菌芽孢形成率提高至87.93%。Das等通過多變量響應面建模和基于遺傳算法的優(yōu)化,每克生物量芽孢數(shù)量達到6×1012 個。陳秋紅等在15L自動發(fā)酵罐中擴大培養(yǎng)凝結芽孢桿菌,控制溶氧30%以上,培養(yǎng)20h,芽孢數(shù)量達到5.8×108 CFU·mL-1,芽孢形成率96.7%。黃曉雪等發(fā)現(xiàn),以紗布屑為固體載體對凝結芽孢桿菌產(chǎn)芽孢有促進作用。楊立華發(fā)現(xiàn)西紅柿汁有顯著的促孢作用。戚薇等利用中空纖維超濾裝置高密度培養(yǎng)凝結芽孢桿菌TQ33,菌濃和芽孢數(shù)量分別達到1.6×1010 CFU·mL-1和1.2×1010 CFU·mL-1,是分批培養(yǎng)的21倍和37倍。另外,無機鹽在調控芽孢形成中也發(fā)揮著重要作用; Mn2+能促進芽孢的形成。
4結 論
凝結芽孢桿菌因益生作用和高抗逆特性,已經(jīng)受到廣泛關注,開發(fā)了越來越多的凝結芽孢桿菌保健品和制劑。相信,在不久的將來,凝結芽孢桿菌保健品和藥品能夠更好地惠及人們,保障人們的健康。
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