蠟樣芽孢桿菌與糞腸球菌協(xié)同發(fā)酵豆粕工藝條件優(yōu)化

2020-04-30 15:58:51 點(diǎn)擊：

摘要：試驗(yàn)研究了不同發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵豆粕品質(zhì)的影響，采用單因素優(yōu)化，逐級(jí)遞進(jìn)法，對(duì)豆粕發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。以豆粕為原料，以益生蠟樣芽孢桿菌和糞腸球菌作為發(fā)酵菌種進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)研究，主要考察其對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物酸溶蛋白和總有機(jī)酸的影響。結(jié)果表明，豆粕固體發(fā)酵最優(yōu)工藝條件為：發(fā)酵菌種比2：1（蠟樣芽孢桿菌菌液：糞腸球菌菌液=2：1）、發(fā)酵初始含水量45%，發(fā)酵時(shí)間54h、好氧與厭氧時(shí)間比2：1，在此發(fā)酵條件下酸溶蛋白達(dá)到14.95%、總有機(jī)酸2.47%、抗原蛋白降解率在90%以上。

豆粕是大豆油加工的副產(chǎn)品，也是理想型動(dòng)物飼料原料之一，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，其中蛋白質(zhì)含量約為45%，碳水化合物約為15%，氨基酸平衡（其中賴氨酸含量最高），且價(jià)格相對(duì)低廉，在畜牧業(yè)中起著重要的作用。豆粕含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，主要分為4大類：熱敏型、熱穩(wěn)定型、抗維生素因子、其他抗?fàn)I養(yǎng)因子。熱穩(wěn)定型抗?fàn)I養(yǎng)因子，包括植酸、寡糖、單寧、抗原蛋白，抗原蛋白以大豆球蛋白和β-伴豆球蛋白為主。發(fā)酵豆粕有助于提升豆粕風(fēng)味，降解抗?fàn)I養(yǎng)因子，增加動(dòng)物對(duì)豆粕營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率。益生微生物，如乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌等，可在數(shù)量上或種類上對(duì)腸道內(nèi)減少或缺乏的益生微生物進(jìn)行補(bǔ)充，調(diào)節(jié)腸道微生物平衡，增強(qiáng)機(jī)體消化吸收，增強(qiáng)免疫力，以提高飼料轉(zhuǎn)化率、畜禽生產(chǎn)性能及防病治病等目的，同時(shí)可以降低畜禽產(chǎn)品的膽固醇含量，減少硫化氫等有毒有害物質(zhì)，滿足畜牧業(yè)綠色、安全、可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略。本研究以豆粕為發(fā)酵原料，將豆粕經(jīng)熟化后，利用益生微生物發(fā)酵，比較不同菌種對(duì)豆粕發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)、酸溶蛋白以及總有機(jī)酸的影響，獲得優(yōu)勢(shì)菌株，并在此基礎(chǔ)上，利用微生物協(xié)同發(fā)酵豆粕，研究不同發(fā)酵條件下，對(duì)發(fā)酵豆粕指標(biāo)的影響，得出較佳發(fā)酵條件，為后期中試奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

豆粕（46%蛋白）由良海糧油有限公司提供；假絲酵母、糞腸球菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌由浙江科峰生物科技有限公司提供。硼酸、濃硫酸、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、乙醇、三氯乙酸、甲基紅、溴甲酚綠、甘氨酸、TRIS等均為分析純，購(gòu)自試劑公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

JY1002電子天平，上海天美天平儀器有限公司；JA1003N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；YJ875A型超凈工作臺(tái)，吳江偉峰凈化設(shè)備有限公司；XFLS-40MB壓力蒸汽滅菌鍋，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；202A電熱恒溫干燥箱，上海錦屏儀器儀表有限公司；HC-3018高速離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；SPX-100/150/250BZ生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；CXC-06粗纖維測(cè)定儀、KDN-20C消化爐、KDN-04B凱氏定氮，浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司；DYY-6C電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 豆粕發(fā)酵菌株的篩選

分別取6kg豆粕原料，分12組，100℃熟化15min，待冷卻至室溫后，按接種量10%分別接種地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、假絲酵母、糞腸球菌，并補(bǔ)水至飼料總含水量為42%，攪拌均勻后于室溫培養(yǎng)，即固態(tài)發(fā)酵，分為厭氧與好氧發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間48h，每組3個(gè)平行。將發(fā)酵48h的飼料于90℃烘干，并粉碎，過(guò)60目篩，檢測(cè)粗蛋白質(zhì)、酸溶蛋白（相對(duì)粗蛋白質(zhì)）、總有機(jī)酸（以乳酸計(jì)）。

1.3.2 粗蛋白質(zhì)的測(cè)定

粗蛋白含質(zhì)量測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB 5009.5—2016。

1.3.3 水分的測(cè)定

水分含量測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB/T 6435—2006。

1.3.4 酸溶蛋白（相對(duì)粗蛋白質(zhì)）的測(cè)定

酸溶蛋白含量測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB/T 2653—2004。

1.3.5 粗纖維的測(cè)定

粗纖維含量的測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB/T 6434—2006。

1.3.6 總有機(jī)酸（以乳酸計(jì)）的測(cè)定

總有機(jī)酸的測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.157—2003。

1.3.7 抗原蛋白降解情況分析

十二烷基磺酸鈉——聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

樣品處理：取1g粉碎樣品（原料和發(fā)酵樣品），加入20.0mL0.03mol/L的Tris-HCl（含0.01mol/Lβ-巰基乙醇），室溫下浸泡1h（每10min攪拌一次），5000r/min離心20min，取上清80μL，加入20μL5×樣品緩沖液，作為上樣樣品，進(jìn)行SDS-PAGE。對(duì)比蛋白條帶，直接定性判定抗原降解情況。

1.3.8 發(fā)酵條件優(yōu)化

單因素發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)：對(duì)菌種比例（蠟樣芽孢桿菌：糞腸球菌）（1：3、1：2、1：1、2：1、3：1），發(fā)酵初始含水量（35%、38%、40%、45%、50%），發(fā)酵時(shí)間（36h、42h、48h、54h、60h）和好氧與厭氧發(fā)酵時(shí)間比（1：3、1：2、1：1、2：1、3：1）等不同的發(fā)酵條件進(jìn)行研究，其中每?jī)?yōu)化一個(gè)發(fā)酵條件的最佳條件作為后續(xù)研究。

2結(jié)果與分析

2.1 不同菌株對(duì)豆粕發(fā)酵的影響（見表1）

本試驗(yàn)過(guò)程中，蠟樣芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌起溫快，其次是假絲酵母，次之為糞腸球菌，通過(guò)對(duì)發(fā)酵樣品粉碎處理后，假絲酵母發(fā)酵后的豆粕氣味帶有獨(dú)特的酵母芳香味且顏色為黃色，兩株芽孢桿菌均帶有氨味且顏色為深黃色至褐黃色，糞腸球菌帶有乳酸香味且顏色為淡黃色。如表1所示，假絲酵母在好氧條件下，對(duì)粗蛋白質(zhì)的提升優(yōu)于厭氧發(fā)酵，總酸指標(biāo)差于厭氧發(fā)酵；地衣芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌在好氧條件下，對(duì)提升粗蛋白質(zhì)和酸溶等方面優(yōu)于厭氧發(fā)酵，總酸則低于厭氧發(fā)酵總體來(lái)說(shuō)，蠟樣芽孢桿菌優(yōu)于地衣芽孢桿菌；糞腸球菌在好氧或厭氧條件下發(fā)酵對(duì)蛋白質(zhì)的提升差異不顯著，但厭氧條件下總酸顯著高于好氧發(fā)酵。因此，選擇蠟樣芽孢桿菌和糞腸球菌作為后續(xù)試驗(yàn)研究菌株。

2.2 不同菌種比例對(duì)酸溶蛋白和總酸的影響（見圖1）

由圖1可知，在好氧條件下，酸溶蛋白隨著蠟樣芽孢桿菌添加比例的上升逐漸增加，菌種比例達(dá)到2：1后，基本不變，此時(shí)，酸溶蛋白達(dá)到12.76%，總酸整體趨勢(shì)則相反，因糞腸球菌產(chǎn)乳酸需要厭氧環(huán)境，此條件下，菌體生長(zhǎng)基本被抑制，考慮到發(fā)酵風(fēng)味及色澤，選擇菌種添加比例為2：1作為后續(xù)研究。

2.3 發(fā)酵初始含水量對(duì)酸溶蛋白和總酸的影響（見圖2）

由圖2可知，豆粕中初始含水量對(duì)發(fā)酵后期酸溶蛋白和總酸的影響較大，在研究范圍內(nèi)，酸溶蛋白和總酸隨著含水量上升，呈現(xiàn)正相關(guān)，含水量達(dá)到45%時(shí)，發(fā)酵48h粉碎樣品顏色為褐黃色且氣味略帶氨味，含水量達(dá)到50%時(shí)，發(fā)酵后期，明顯的氨臭味，且十分黏稠，整體感官較差，故選擇初始含水量為45%作為后續(xù)研究。

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸溶蛋白和總酸的影響（見圖3）

由圖3可知，發(fā)酵時(shí)間的變化對(duì)整體酸溶蛋白含量有較大影響，而總酸影響并不大，可能是由于蠟樣芽孢桿菌和糞腸球菌均可產(chǎn)生部分有機(jī)酸，但在好氧條件下，糞腸球菌生長(zhǎng)被抑制，而后期由于物料黏度上升，透氣性下降，出現(xiàn)厭氧條件，其開始生長(zhǎng)，有機(jī)酸積累開始加快，考慮到發(fā)酵豆粕感官，以及相應(yīng)的指標(biāo)，選擇發(fā)酵54h作為后續(xù)研究，此時(shí)，酸溶蛋白含量達(dá)到15.95%，總酸1.78%。

2.5 好氧與厭氧發(fā)酵時(shí)間比對(duì)酸溶蛋白和總酸的影響（見圖4）

本試驗(yàn)選擇54h作為發(fā)酵終止時(shí)間，結(jié)合工藝，首先進(jìn)行好氧發(fā)酵，選擇發(fā)酵時(shí)間：13.5、18.0、27.0、36.0、40.5h，后續(xù)采用厭氧發(fā)酵（呼吸袋抽真空），選擇發(fā)酵時(shí)間40.5、36.0、27.0、18.0、13.5h。結(jié)果如圖4所示，總酸隨著好氧時(shí)間的增加而逐漸降低，但可以發(fā)現(xiàn)，時(shí)間比在1：1之后，總酸下降幅度減小，可能是由于蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)有機(jī)酸，彌補(bǔ)了糞腸球菌的產(chǎn)酸空白部分，酸溶蛋白則是呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，考慮到整體指標(biāo)和感官指標(biāo)，選擇2：1比例較佳，此時(shí)酸溶蛋白達(dá)到14.95%，總酸達(dá)2.47%。

2.6 最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵豆粕中抗原蛋白的降解情況分析（見圖5）

由圖5可知，泳道1為發(fā)酵菌比（2：1），發(fā)酵水分45%，發(fā)酵時(shí)間54h，好氧與厭氧發(fā)酵時(shí)間比（2：1）條件下，發(fā)酵豆粕粉碎成品的蛋白電泳圖，抗原蛋白主要包括α-大豆球蛋白和β-伴豆球蛋白，從圖中分析，幾乎看不到抗原蛋白的條帶，介于0%豆粕~10%豆粕原料蛋白條帶之間，抗原蛋白的降解率在90%以上，故在該試驗(yàn)條件下，酸溶蛋白，總酸及抗原蛋白降解率均獲得較佳結(jié)果。

3討論

本試驗(yàn)研究了不同發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵豆粕品質(zhì)的影響，采用單因素優(yōu)化，逐級(jí)遞進(jìn)法，對(duì)豆粕發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)指標(biāo)檢測(cè)，獲得最佳發(fā)酵條件：蠟樣芽孢桿菌與糞腸球菌菌液為2：1，發(fā)酵初始含水量為45%，發(fā)酵時(shí)間54h，好氧與厭氧發(fā)酵時(shí)間比為2：1。在最佳發(fā)酵條件下酸溶蛋白為14.95%，總酸2.47%，抗原蛋白降解率在90%以上。本研究以豆粕為原料，蠟樣芽孢桿菌和糞腸球菌協(xié)同發(fā)酵，拓寬了發(fā)酵豆粕的菌種選擇范圍，可為后期發(fā)酵豆粕的優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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