復(fù)合益生菌發(fā)酵鮮食大豆秸稈工藝與飼用品質(zhì)的研究
我國是人口大國，對肉類的需求量很大，有必要大力發(fā)展畜牧業(yè)，然而長期以來草食畜禽飼料價格昂貴，直接導(dǎo)致飼養(yǎng)成本過高，從而影響了畜禽養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益。開發(fā)和利用各種潛在的飼料資源對發(fā)展我國畜牧業(yè)具有十分重要的意義。我國各類農(nóng)作物秸稈資源十分豐富。據(jù)估計，我國每年農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量達7億多t，占世界秸稈總產(chǎn)量的30%。但資源利用并不合理，據(jù)初步調(diào)查，秸稈總利用率僅為百分之十幾。絕大部分秸稈被閑置堆放或者焚燒處理，不僅造成極大的資源浪費和嚴重的環(huán)境污染，而且還導(dǎo)致火災(zāi)和交通事故的頻繁發(fā)生。其實這些秸稈是巨大的潛在飼料資源，可以直接飼喂反芻動物，也可以作為畜禽飼料的原料。將秸稈等農(nóng)副產(chǎn)物用作飼料不僅可以減少環(huán)境污染，還可變廢為寶，解決目前飼料資源不足和價格昂貴等問題。
豆秸是豆類的副產(chǎn)品，每年豆秸產(chǎn)量達1500萬t。豆秸資源長期沒有得到合理有效的開發(fā)和利用，約2/3的豆秸被焚燒掉，造成資源浪費和環(huán)境污染。豆秸不能很好地用作飼料的主要原因是質(zhì)地粗硬、適口性差和營養(yǎng)價值低。利用益生菌發(fā)酵飼料不僅能改善飼料的適口性，提高飼料的消化率，增加營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，而且能促進動物生長，調(diào)節(jié)胃腸道菌群，畜禽飼喂益生菌發(fā)酵飼料可以提高生產(chǎn)性能和抗病能力，還可以減少抗生素的使用，為人類提供健康安全的動物產(chǎn)品。
本文章采用復(fù)合益生菌發(fā)酵技術(shù)，研發(fā)復(fù)合益生菌發(fā)酵鮮食大豆秸稈的工藝，并探討發(fā)酵對鮮食大豆秸稈營養(yǎng)價值的影響，為鮮食大豆秸稈的飼料資源化利用提供技術(shù)支撐。
1材料與方法
1.1 試驗材料
研究的鮮食大豆秸稈飼料樣品采集于上海市奉賢區(qū)金匯鎮(zhèn)，品種為青酥一號，為采摘鮮食大豆豆莢后的剩余物。復(fù)合益生菌發(fā)酵液由上海創(chuàng)博生態(tài)工程有限公司提供，主要成分為乳酸桿菌、枯草芽胞桿菌和酵母菌等，其中活菌數(shù)≥50億CFU/mL，乳酸菌數(shù)≥12億CFU/mL。糖蜜由上海創(chuàng)博生態(tài)工程有限公司提供。
1.2 主要試劑和儀器
營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基均購自于美國BD公司，胰蛋白酶抑制因子ELISA試劑盒購自于上海源葉生物技術(shù)有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
紫外可見分光光度計購自尤尼科上海儀器有限公司，生物冷凍離心機購自德國Eppendoff公司，全自動凱氏定氮儀購自于美國foss公司，氧彈熱量計購自于上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司，pH酸度計購自于上海精科實業(yè)有限公司。
1.3 發(fā)酵工藝
將采集的鮮食大豆秸稈通過粉碎機粉碎為0.5cm左右，調(diào)節(jié)水分含量至35%，添加5%復(fù)合益生菌菌液和不同比例的糖蜜(0、1%、3%和5%)，攪拌均勻，裝入錫箔袋中(300g/袋)，每處理12袋，總共48袋。用封口機將鋁箔袋真空密封后放于30℃恒溫箱進行固體厭氧發(fā)酵，分別發(fā)酵0、7、15和30d，然后依次放入－20℃冰箱中保存待測。發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵飼料取出一部分放于烘箱65℃烘干后粉碎過40目篩，保存供分析用。
1.4 測定指標和方法
1.4.1 飼料感官評定
從質(zhì)地、顏色和氣味等方面對鮮食大豆秸稈發(fā)酵飼料品質(zhì)進行評定。
1.4.2 營養(yǎng)物質(zhì)的測定
通過概略養(yǎng)分分析方法測定發(fā)酵飼料中營養(yǎng)成分的差異。
1.4.2.1 干物質(zhì)
按照GB/T6435—2006的方法測定。
1.4.2.2 粗蛋白
按照GB/T6432—1994用凱氏定氮法測定。
1.4.2.3 粗脂肪
按照GB/T6433—2006用索氏浸提法測定。
1.4.2.4 粗灰分
按照GB/T6438—2007用灼燒法測定。
1.4.2.5 鈣
按照GB/T6436—2002用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)絡(luò)合滴定快速法測定。
1.4.2.6 總磷
按照GB/T6437—2002用釩鉬黃比色法測定。
1.4.2.7 粗纖維
按照GB/T6434—2006用酸堿醇醚洗滌法測定。
1.4.2.8 中性洗滌纖維
按照GB/T20806—2006的方法測定。
1.4.2.9 酸性洗滌纖維
按照NY/T1459—2007的方法測定。
1.4.2.10 有機物
有機物/%=干物質(zhì)－粗灰分。
1.4.2.11 無氮浸出物
無氮浸出物/%=有機物－(粗脂肪+粗纖維+粗蛋白)。
1.4.2.12 干物質(zhì)回收率
干物質(zhì)回收率/%=發(fā)酵后飼料干物質(zhì)/發(fā)酵前飼料干物質(zhì)×100。
1.4.3 微生物的測定
1.4.3.1總菌數(shù)
按照GB/T13093—91進行測定。
1.4.3.2 乳酸菌數(shù)
準確稱取發(fā)酵飼料10g于三角瓶中，倒入100mL無菌水，放于恒溫搖床37℃，160r/min，搖動30min后稀釋適當質(zhì)量濃度，吸取上清液1mL于滅菌的培養(yǎng)皿中，然后倒入冷至50℃的MRS培養(yǎng)基，混勻。放于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h后，進行菌落計數(shù)。
1.4.4 pH、乳酸含量和總能的測定
1.4.4.1 pH
準確稱取10g發(fā)酵飼料于三角瓶中，加入50mL無菌水，用3層醫(yī)用紗布包裹后用力榨取得粗提液，過濾后用pH酸度計測定。
1.4.4.2 乳酸
參照羅建等(2012)，利用羥基聯(lián)苯比色法測定。
1.4.4.3 總能
按照NY/T12—1985的方法用氧彈式熱量計測定。
1.4.5 抗營養(yǎng)因子的測定
1.4.5.1 胰蛋白酶抑制因子
按照胰蛋白酶抑制因子ELISA試劑盒測定。
1.4.5.2 尿素酶活性
按照GB/T8622—2006進行測定。
1.5 數(shù)據(jù)分析
所有試驗重復(fù)3次以上，試驗所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，用Duncan氏法進行多重比較，以P＜0.05為差異顯著性標準，結(jié)果用平均值±標準差表示。
2結(jié)果與分析
2.1 飼料感官評定
飼料的感官評定結(jié)果直接影響到飼料發(fā)酵效果的好壞。試驗的感官評定由4 個人合作完成，以確保試驗結(jié)果的準確性。發(fā)酵鮮食豆秸感官評定結(jié)果見表1，不同發(fā)酵天數(shù)和糖蜜添加量的發(fā)酵鮮食豆秸具有不同的感官評定結(jié)果。未發(fā)酵飼料質(zhì)地一般、顏色為淡黃色且無酸味，發(fā)酵后的飼料質(zhì)地良好、顏色為亮黃色或金黃色且有酸味。從發(fā)酵時間來看，隨著發(fā)酵時間的延長，飼料質(zhì)地變好、顏色變深和酸味增強; 從糖蜜添加量來看，隨著糖蜜添加量的增加，飼料質(zhì)地變好、顏色變深及酸味增強。從感官評定結(jié)果來看，處理12、處理15 和處理16 這3 組發(fā)酵效果最好，質(zhì)地均良好，顏色均為金黃色，并且均有強酸味。肉眼觀察到發(fā)酵后鋁箔袋中產(chǎn)生大量的氣體，該氣體應(yīng)該是復(fù)合益生菌固體厭氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氣體。
2.2 營養(yǎng)成分分析
發(fā)酵鮮食豆秸干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪測定結(jié)果見表2。發(fā)酵飼料干物質(zhì)含量接近60%，各處理組干物質(zhì)含量間有顯著性差異(P＜0.05)，可能與初始糖蜜添加量不同有關(guān)。發(fā)酵前后飼料粗蛋白含量無顯著性差異(P＞0.05)，都在13.5%左右，發(fā)酵前后飼料粗脂肪含量無顯著性差異(P＞0.05)，都在2.8%左右，說明發(fā)酵過程中粗蛋白和粗脂肪含量幾乎沒有變化。
發(fā)酵鮮食豆秸干物質(zhì)回收率、酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量見表3。干物質(zhì)回收率越高表明飼料營養(yǎng)成分損失越少。發(fā)酵后所有處理組干物質(zhì)回收率都達到98%以上，說明所有處理組營養(yǎng)成分損失都很少。隨著發(fā)酵時間的延長，干物質(zhì)回收率緩慢地減少。相同糖蜜添加量的情況下，不同發(fā)酵天數(shù)間的干物質(zhì)回收率差異顯著(P＜0.05)。發(fā)酵前后飼料中酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量均有顯著性差異(P＜0.05)，發(fā)酵能明顯減少飼料中酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量。從酸性洗滌纖維含量來看，處理8、處理11、處理12、處理15和處理16這5組含量最低，均低于42%。從中性洗滌纖維含量來看，處理組12、處理15和處理16這3組含量最低，均低于53.5%。
發(fā)酵鮮食豆秸粗灰分、鈣和磷含量見表4。處理1粗灰分含量最低，約為6.98%，發(fā)酵后飼料粗灰分含量顯著上升(P＜0.05)。各處理組飼料粗灰分含量也有所差異，處理12、處理15和處理16含量最高且差異不顯著(P＞0.05)。處理1鈣和磷含量最低，分別為1.19%和0.30%，發(fā)酵后飼料鈣和磷含量顯著上升(P＜0.05)。各處理組飼料鈣和磷含量也有所差異，處理12、處理15和處理16含量最高且差異不顯著(P＞0.05)。
發(fā)酵鮮食豆秸粗纖維、有機物和無氮浸出物含量見表5。與處理1相比，發(fā)酵能顯著減少粗纖維的含量(P＜0.05)，但是不同發(fā)酵組飼料粗纖維含量差異不顯著(P＞0.05)。所有處理組有機物含量都很高，均在92%以上，處理1含量最高，約為93.02%，處理8和處理11其次，處理15和處理16最低。無氮浸出物主要由淀粉、雙糖和單糖等可溶性糖類組成。所有處理組無氮浸出物含量都很接近，約為35%，各處理組間差異不顯著(P＞0.05)。
2.3 微生物的含量
發(fā)酵鮮食豆秸總菌和乳酸菌含量見表6。與發(fā)酵前相比，發(fā)酵后總菌數(shù)和乳酸菌含量大幅度上升且差異顯著(P＜0.05)。不同發(fā)酵組總菌和乳酸菌含量也有所差異，處理15和處理16總菌含量最高，超過22億CFU/g，乳酸菌含量也最高，約為23億CFU/g，但是處理15和處理16總菌和乳酸菌含量相近，無顯著差異(P＞0.05)。對照組總菌和乳酸菌含量很低，幾乎測定不出。隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，總菌和乳酸菌含量有所升高。隨著糖蜜添加量的增加，總菌和乳酸菌含量也有所升高。
2.4 pH、乳酸含量和總能變化
pH和乳酸含量是評價發(fā)酵飼料品質(zhì)的重要指標。從表7可見:未發(fā)酵飼料pH約為6.51。與處理1相比，發(fā)酵后pH顯著降低(P＜0.05)。不同發(fā)酵組pH也有所差異，處理15和處理16的pH最低，約為4.8并且差異不顯著(P＞0.05)。發(fā)酵前后飼料乳酸含量差異顯著(P＜0.05)，未發(fā)酵飼料乳酸含量很低，幾乎測定不出。不同處理組乳酸含量也有所差異，但是處理15和處理16乳酸含量最高并且差異不顯著(P＞0.05)。發(fā)酵提高了乳酸含量并降低了pH可能是由于隨著發(fā)酵時間的延長，乳酸菌大量繁殖，從而分泌大量乳酸，進而降低pH。發(fā)酵前后飼料總能有所差異，處理15和處理16總能最高，約為19.5KJ/g且差異不顯著(P＞0.05)。
2.5 抗營養(yǎng)因子含量
發(fā)酵鮮食豆秸胰蛋白酶抑制因子含量和脲酶活性見表8。未發(fā)酵飼料胰蛋白酶抑制因子含量最高，約為0.03mg/g。與處理1相比，發(fā)酵后飼料胰蛋白酶抑制因子含量顯著降低(P＜0.05)。不同發(fā)酵組胰蛋白酶抑制因子含量也有所差異，處理12、處理15和處理16胰蛋白酶抑制因子含量最低，幾乎測定不出。未發(fā)酵飼料脲酶活性最高，約為0.2mg/(g·min)。與處理1相比，發(fā)酵后飼料脲酶活性顯著降低(P＜0.05)，且接近0。
討 論
豆秸產(chǎn)量比玉米秸和小麥秸等其他農(nóng)作物副產(chǎn)物產(chǎn)量要低，粗纖維含量很高限制了其應(yīng)用，但是其粗蛋白含量很高，可以考慮作為一種非常規(guī)飼料資源進行開發(fā)利用。生產(chǎn)中一般采用水解、膨化和酶解等方法處理非常規(guī)飼料，由于加工技術(shù)不成熟，部分加工方式破壞了飼料的營養(yǎng)價值，而且加工成本還很高，缺乏競爭力。利用益生菌發(fā)酵不僅能提高蛋白質(zhì)的含量，降低粗纖維含量，而且還能降低仔豬腹瀉，預(yù)防腸道疾病的發(fā)生，為人們提供健康的動物產(chǎn)品。
據(jù)劉瑞麗等(2011)報道，利用復(fù)合益生菌發(fā)酵能提高飼料品質(zhì)。廖雪義等(2009)用混合菌種發(fā)酵秸稈，終產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量從2.2%增加到24.61%，粗纖維含量從36.2%下降到18.47%。蔡俊等(2005)將發(fā)酵飼料飼喂生長育肥豬，發(fā)現(xiàn)益生菌發(fā)酵飼料可改善豬的生長性能。
根椐試驗，利用復(fù)合益生菌發(fā)酵鮮食大豆秸稈飼料可顯著提高飼料中益生菌數(shù)量，主要是乳酸菌的數(shù)量，產(chǎn)生大量的乳酸，并降低飼料pH。王旭明等(2002)研究表明，復(fù)合益生菌對飼料有明顯的酸化作用，能使pH明顯降低。試驗通過對總菌數(shù)、乳酸菌、乳酸和pH的分析得知，隨著發(fā)酵時間的延長，微生物發(fā)酵厭氧程度逐漸加強，使環(huán)境更加有利于乳酸菌的增殖，從而產(chǎn)生大量乳酸。隨著乳酸的升高，飼料pH降低，繼續(xù)發(fā)酵，乳酸菌成為優(yōu)勢種群，從而抑制其他微生物的生長。
豆粕中存在多種抗營養(yǎng)因子，對動物的生長和健康能造成很多不良影響，極大的影響豆粕的飼用價值。試驗中未發(fā)酵的鮮食大豆秸稈飼料中胰蛋白酶抑制因子含量和脲酶活性就很低，發(fā)酵之后發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶抑制因子含量和脲酶活性幾乎檢測不出。馬文強等(2008)利用酵母菌、乳酸菌和枯草芽孢桿菌的混菌發(fā)酵，使抗營養(yǎng)因子降解率達到90%。Hoffman(2003)等利用瘤胃微生物發(fā)酵除去胰蛋白酶抑制因子，降解率達到了90%以上。
復(fù)合益生菌發(fā)酵需要合適的發(fā)酵條件，發(fā)酵工藝參數(shù)包括底物含水量、菌液接種量、糖蜜添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間等。試驗底物含水量選在35%，菌液接種量選在5%，發(fā)酵溫度控制在30℃，糖蜜添加量選擇了0、1%、3%和5%4個梯度，發(fā)酵時間選擇了0、7、15和30d4個梯度，經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)處理15(發(fā)酵30d，糖蜜添加3%)和處理16(發(fā)酵30d，糖蜜添加5%)發(fā)酵飼料品質(zhì)最好，但是考慮到經(jīng)濟效益，選擇處理15(發(fā)酵30d，糖蜜添加3%)為最優(yōu)的發(fā)酵工藝。
4結(jié) 論
復(fù)合益生菌發(fā)酵能顯著提高鮮食大豆秸稈飼料品質(zhì)，并且發(fā)酵過程中干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)幾乎沒有損失。復(fù)合益生菌發(fā)酵能降低鮮食大豆秸稈飼料中粗纖維、酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量，同時提高粗灰分、鈣和磷含量。同時降低pH、胰蛋白酶抑制因子含量和脲酶活性。因此，底物含水量35%，菌液接種量5%，發(fā)酵溫度30℃，糖蜜添加量3%，發(fā)酵時間30d是鮮食大豆秸稈飼料最優(yōu)發(fā)酵工藝。
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