豆渣固態(tài)發(fā)酵過程中主要營養(yǎng)成分及抗氧化特性變化
導(dǎo)讀
大豆是亞洲地區(qū)重要的糧油作物之一。隨著豆制品加工技術(shù)的成熟和消費需求的增長，作為豆?jié){、豆腐或其他大豆產(chǎn)品生產(chǎn)中所產(chǎn)生的主要副產(chǎn)品，豆渣除小部分作為牲畜飼料外，大部分被當(dāng)成工業(yè)廢料丟棄。然而，豆渣含有豐富的膳食纖維、蛋白質(zhì)、脂肪、異黃酮和維生素等，具有豐富的營養(yǎng)價值。目前，世界上越來越多的國家將豆渣看作是一種新的保健食品源，在我國豆渣資源尚未被充分利用。
固態(tài)發(fā)酵技術(shù)是一種經(jīng)濟方便的發(fā)酵技術(shù)，被廣泛地應(yīng)用于食品生產(chǎn)和加工過程中。微生物在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的復(fù)雜酶系和眾多活性物質(zhì)，可以提高豆渣的營養(yǎng)價值、改善口感、提高產(chǎn)品的生物活性。近幾年來，使用豆渣進行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)一些具有生物活性的化合物的研究日益增多，李紅艷等報道豆渣經(jīng)粗壯脈紋孢菌發(fā)酵，類胡蘿卜素含量大大增加。Zhu Yunping等利用枯草桿菌（Bacillus subtilisB2）固態(tài)發(fā)酵，可以得到一種叫做1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）的物質(zhì)，DNJ是一種糖苷酶抑制劑，可以用于糖尿病患者。還有研究表明，可以利用青霉菌發(fā)酵豆渣得到新型殺蟲劑。但國內(nèi)將豆渣直接應(yīng)用開發(fā)為功能性食品的研究以及對發(fā)酵豆渣食品特性的研究較少。
在國外，Kronenberg、Matuso等對微生物發(fā)酵豆渣的營養(yǎng)成分及食品特性進行了研究，而均未對發(fā)酵豆渣的抗氧化功能特性進行深入研究。為此本實驗以傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵工藝為基礎(chǔ)，研究了米根霉及少孢根霉兩株霉菌在豆渣發(fā)酵過程的情況，對發(fā)酵過程中主要營養(yǎng)成分及抗氧化活性進行測定，與未發(fā)酵的豆渣進行對比，為開發(fā)利用豆渣制成的功能性食品提供理論參考。
1.1 材料、菌株與試劑
大豆購買于江蘇省南京市蘇果超市。少孢根霉（Rhizopus oligosporus RT-3）、米根霉（Rhizopus oryzae）均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實驗室保存。
2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、菲洛嗪、水溶性VE（Trolox） 美國Sigma公司；乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic aciddisodium salt，EDTA-2Na）、氯化鐵、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸等均為分析純試劑。
1.2 儀器與設(shè)備
TM2300全自動凱氏定氮儀丹麥Foss公司；微波消解儀意大利Milestone公司；索式脂肪抽提裝置上海華瑞儀器有限公司；SX2-4-13數(shù)顯控溫馬弗爐上海蘇凈實業(yè)有限公司；LHS-150SC恒溫恒濕箱上海一恒科技有限公司；AUY-120分析天平、UV-2450紫外分光光度計日本Shimadzu公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司；酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek公司；64RL高速冷凍離心機美國Beckeman公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海益恒實驗儀器有限公司；手提式不銹鋼蒸汽消毒器上海三申醫(yī)療器械有限公司。
1.3 方法
1.3.1 發(fā)酵豆渣的制備
稱取大豆1 000 g，加入3 000 mL蒸餾水，室溫條件下浸泡12 h。以1∶7（m/V）的豆水比進行磨漿，制得含水量85%的新鮮豆渣。將新鮮豆渣烘至含水量為60%后放在121 ℃的高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌15 min。在其中一份豆渣中按1 g/100 mL的接種量接種米根霉的孢子懸浮液（108～109個/mL），另一份豆渣中按同樣的接種量接種少孢根霉的孢子懸浮液（108～109個/mL）?；靹蚝笱b入保鮮袋中并鋪平。鋪平后的豆渣約占保鮮袋面積的1/2，厚度約3 cm，每隔2 cm扎小孔透氣后，置于30 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵30 h。每隔6 h取樣，將取出的樣品冷凍并經(jīng)粉碎機粉碎，過80 目篩備用。
1.3.2 發(fā)酵豆渣理化指標(biāo)測定
1.3.2.1 膳食纖維含量的測定
參照GB/T 5009.88—2008《食品中膳食纖維的測定》。
1.3.2.2 粗蛋白含量的測定
參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》。
1.3.2.3 粗脂肪含量的測定
參照GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的測定》。
1.3.2.4 灰分含量的測定
參照GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》。
1.3.2.5 還原糖含量的測定
1 g凍干樣品置于25 mL 蒸餾水中，50 ℃水浴搖床提取30 min，4 ℃、8 000×g離心15 min，取上清液定容至100 mL待測。采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定樣品還原糖含量。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果以葡萄糖當(dāng)量表示（mg/g，以豆渣凍干粉計）。
1.3.2.6 可溶性蛋白含量的測定
1 g凍干樣品置于25 mL pH 9.0 硼酸-氫氧化鈉緩沖液，室溫條件下超聲輔助提取1 h，4 ℃、8 000×g離心15 min，取上清液定容至25 mL待測。采用考馬斯亮藍法測定樣品中的可溶性蛋白含量。以牛血清白蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果以牛血清白蛋白當(dāng)量表示（mg BSA/g，以豆渣凍干粉計）。
1.3.2.7 纖維素酶活力測定
1 g凍干樣品置于20 mL 0.1 mol/L pH 4.8的乙酸鈉緩沖溶液中，磁力攪拌30 min，4 ℃、8 000×g離心15 min，上清液則為粗酶液。纖維素酶活力的測定采用文獻報道的方法。
酶活力單位（U）定義：50 ℃、pH 4.8時每分鐘水解生成1 μg葡萄糖所需要的酶量。
1.3.2.8 糖化酶活力測定
粗酶液制備方法同1.3.2.7節(jié)。糖化酶活力的測定采用文獻報道的方法。
酶活力單位（U）定義：30 ℃、pH 4.8時每分鐘水解生成1 mg葡萄糖所需要的酶量。
1.3.2.9 蛋白酶活力測定
以1∶20的料液比于蒸餾水中室溫條件下提取1 h，4 ℃、8 000×g離心15 min，上清液則為粗酶液。參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中關(guān)于蛋白酶活力測定的方法測定樣品中的蛋白酶活力。
酶活力單位（U）定義：40 ℃，pH 7.5時每分鐘從可溶性酪蛋白中水解生成1 μg酪氨酸所需要的酶量。
1.3.3 發(fā)酵豆渣抗氧化活性的測定
1.3.3.1 水溶性提取物的制備
1 g凍干樣品置于25 mL蒸餾水，50 ℃水浴搖床提取4 h，8 000×g離心15 min，定容至25 mL，上清液以0.45 μm膜過濾，即為發(fā)酵豆渣水溶性提取物。
1.3.3.2 還原力測定
還原力的測定采用文獻報道的方法。先后在200 μL樣品溶液中加入1 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液和1 mL 1 g/100 mL鐵氰化鉀溶液?；靹?，50 ℃水浴20 min，取出后流水迅速冷卻，再加入1 mL 10 g/100 mL三氯乙酸。取1 mL上清液加入200 μL 1 mg/mL氯化鐵溶液。10 min后于700 nm波長處測吸光度。以Trolox質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果以Trolox的當(dāng)量表示（μg Trolox/g，以豆渣凍干粉計）。
1.3.3.3 清除ABTS＋•活性測定
清除ABTS＋·能力的測定按照文獻報道的方法。10 mL的7 mmol/LABTS儲備液與20 mL 2.45 mmol/LK2S2O8溶液混合后，室溫下暗反應(yīng)16 h，形成ABTS＋•。使用前用0.01 mol/L磷酸緩沖液稀釋至734 nm波長處吸光度為0.70±0.05時，作為本實驗的ABTS工作液。測定時，取1 mL樣品溶液與4 mL ABTS＋•工作液混合，室溫條件下靜置反應(yīng)6 min后，迅速測定其在734 nm波長處的吸光度。以Trolox質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，ABTS＋•清除率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果以Trolox的當(dāng)量表示（μgTrolox/g，以豆渣凍干粉計）。
1.3.3.4 金屬離子螯合能力測定
金屬離子螯合能力的測定按照文獻報道的方法。先后加入0.50 mL樣品溶液、0.75 mL蒸餾水、2 mmol/L氯化亞鐵溶液，混勻后加入0.10 mL 5 mmol/L菲啰嗪室溫反應(yīng)20 min，測定562 nm波長處吸光度。以EDTA-2Na質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，金屬離子螯合率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果以EDTA-2Na的當(dāng)量表示（μg EDTA-2Na/g，以豆渣凍干粉計）。
1.4 數(shù)據(jù)處理與分析
實驗數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)實驗所得的平均值，結(jié)果表示為±s。采用SPSS 16.0軟件進行顯著性和相關(guān)性分析，采用Origin 8.5軟件作圖。
2結(jié)果和分析
2.1 發(fā)酵豆渣的一般化學(xué)成分分析
對未發(fā)酵豆渣及由米根霉、少孢根霉發(fā)酵的豆渣冷凍干燥后，進行粗蛋白、粗脂肪、灰分、膳食纖維含量的測定（表1）。未發(fā)酵的豆渣蛋白質(zhì)含量為31.76%，經(jīng)過米根霉、少孢根霉發(fā)酵后，蛋白質(zhì)含量分別提高至33.81%、34.47%。同時粗脂肪、灰分的含量也有所提高。一方面由于伴隨著微生物的生長，霉菌菌絲覆蓋整個豆渣表面，霉菌菌絲與豆渣基質(zhì)合二為一，菌絲中的粗蛋白、粗脂肪、灰分均能夠引起發(fā)酵豆渣中相應(yīng)含量的提高。另一方面發(fā)酵過程中隨著微生物生長，豆渣中的部分物質(zhì)被微生物當(dāng)做碳源利用，導(dǎo)致其他營養(yǎng)成分的比例發(fā)生改變，從而導(dǎo)致發(fā)酵后其化學(xué)成分的含量發(fā)生改變。如微生物在發(fā)酵過程中將豆渣中的某些營養(yǎng)物質(zhì)降解為一些小分子物質(zhì)，如醇和酸發(fā)生酯化反應(yīng)，形成酯類物質(zhì)，從而使得乙醚提取物增加，導(dǎo)致粗脂肪含量明顯增加（P＜0.05）。豆渣中總膳食纖維含量很高，占豆渣干質(zhì)量的54.67%，其中主要成分是不可溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF），含量為47.13%，而可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）含量相對較低，只有7.54%。發(fā)酵后，IDF含量有所下降，SDF的含量有所上升，同時IDF和SDF的比值顯著下降（P＜0.05）。發(fā)酵前IDF/SDF為6.25，經(jīng)過米根霉、少孢根霉發(fā)酵后IDF/SDF分別降低到4.06、3.51，這表明發(fā)酵過程中，微生物會產(chǎn)生少量的纖維素酶，將一部分IDF水解成SDF，從而造成IDF/SDF值的變化。
2.2 還原糖含量變化
由圖1可知，豆渣中的還原糖隨著發(fā)酵時間的延長而增加，其中在12～24 h期間顯著增加（P＜0.05），經(jīng)米根霉、少孢根霉發(fā)酵30 h后豆渣還原糖含量分別為30.47、34.28 mg/g，比未發(fā)酵豆渣分別提高了7.31、8.22 倍。由于在發(fā)酵過程中微生物所分泌的纖維素酶及淀粉酶的作用，可將豆渣中的纖維素、淀粉等降解為低分子的還原糖，從而使豆渣中還原糖的含量隨著發(fā)酵時間的延長而增加。
2.3 可溶性蛋白含量變化
由圖2可知，隨著發(fā)酵時間的延長，豆渣的可溶性蛋白質(zhì)含量在0～24 h顯著增加（P＜0.5），之后稍有下降。少孢根霉發(fā)酵豆渣的可溶性蛋白質(zhì)含量由發(fā)酵前的4.17 mg BSA /g增加至9.44 mg BSA /g，米根霉發(fā)酵豆渣的略低于同時間內(nèi)少孢根霉發(fā)酵豆渣，為8.99 mg BSA/g。由于在微生物的發(fā)酵過程中，豆渣中的蛋白質(zhì)被分解成多肽和一些有一定空間結(jié)構(gòu)但分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)，增加了其蛋白質(zhì)的溶解性，所以可溶性蛋白質(zhì)的含量會增加。Sun Hong等采用枯草芽孢桿菌對棉籽粉進行發(fā)酵，也發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的棉籽粉中可溶性蛋白質(zhì)增多。進一步延長發(fā)酵時間，豆渣中的蛋白質(zhì)更多的被降解成氨基酸和分子質(zhì)量更小的小肽物質(zhì)，而考馬斯亮藍法更多是反映大分子可溶性蛋白質(zhì)變化的情況，無法準(zhǔn)確測定其中的氨基酸和小肽，從而造成后期可溶性蛋白質(zhì)呈現(xiàn)下降趨勢。
2.4 纖維素酶活力變化
由圖3可知，發(fā)酵后的豆渣中纖維素酶活力較未發(fā)酵的豆渣有顯著提高（P＜0.05）。發(fā)酵30 h后，經(jīng)米根霉、少孢根霉發(fā)酵的豆渣中纖維素酶活力分別達到1 989.42、2 165.73 U/g，比未發(fā)酵豆渣分別提高了1.62、1.77 倍。纖維素酶活力的變化影響豆渣中膳食纖維的含量。微生物在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的纖維素酶將水不溶性膳食纖維多糖水解，從而使水溶性膳食纖維多糖成分增加。另一方面水不溶性膳食纖維的大大減少導(dǎo)致總膳食纖維含量的降低。霉菌發(fā)酵可適當(dāng)提高豆渣可溶性膳食纖維含量，使得豆渣的抗氧化、抗血壓等功能活性提高。
2.5 糖化酶活力變化
由圖4可知，未發(fā)酵豆渣中糖化酶活力較低，僅為4.90 U/g，經(jīng)米根霉、少孢根霉發(fā)酵后，其糖化酶活力與未發(fā)酵的豆渣相比得到顯著提高（P＜0.05）。米根霉、少孢根霉發(fā)酵的豆渣糖化酶活力均在發(fā)酵24 h達到最大，最高值分別為34.25、36.09 U/g。微生物可以在發(fā)酵過程中分泌產(chǎn)生糖化酶，將豆渣中的碳水化合物糖化，進而提高微生物生長所需要的碳源。繼續(xù)培養(yǎng)，糖化酶活力均稍有下降，此時霉菌生長已經(jīng)處于停滯期，抑制糖化酶活力，從而導(dǎo)致酶活力下降。糖化酶活力的變化與還原糖變化規(guī)律基本一致。
2.6 蛋白酶活力變化
由圖5可知，豆渣在初始發(fā)酵的12 h內(nèi)，蛋白酶活力變化不明顯，可能是因為在0～12 h霉菌孢子處于萌發(fā)狀態(tài)。12 h后，隨著發(fā)酵時間的延長，微生物生長迅速，代謝也逐漸旺盛，蛋白酶活力不斷提高。在24 h經(jīng)米根霉、少孢根霉發(fā)酵的豆渣中蛋白酶活力分別達到796.68、906.47 U/g。但是，隨著發(fā)酵時間的進一步延長，微生物分解蛋白質(zhì)的能力減弱，從而導(dǎo)致蛋白酶活力變化趨于穩(wěn)定。微生物在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的蛋白酶會使得豆渣中的功能性小肽和氨基酸得到部分積累，從而改善豆渣的功能活性。
2.7 發(fā)酵豆渣的抗氧化能力
由于不同的自由基和損傷劑會導(dǎo)致不同的氧化損傷，因此單一的抗氧化體系很難全面體現(xiàn)其生物學(xué)意義，需要相互補充的多種體系來評價樣品在不同體系中的真實效應(yīng)。本研究采用還原能力、ABTS＋·清除能力以及金屬離子螯合能力3 種不同的抗氧化能力評價指標(biāo)，試圖從多個側(cè)面反映豆渣在發(fā)酵過程中抗氧化能力的變化。
2.7.1 還原力變化
由圖6可知，對于少孢根霉和米根霉兩株菌而言，其還原力均隨著發(fā)酵時間的延長而明顯增強。且兩株菌的還原力均在發(fā)酵24 h時達到最大值，分別為677.70、588.24 μg Trolox/g。Yang等認(rèn)為在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了一些還原酮類物質(zhì)，這些物質(zhì)可通過提供電子使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的物質(zhì)，以中斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而導(dǎo)致發(fā)酵后的樣品具有較強的還原能力。除此之外，蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物如小肽物質(zhì)和氨基酸，如亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、組氨酸和色氨酸也能使發(fā)酵后的樣品具有較強的還原能力。隨著發(fā)酵的進行，微生物所分泌的各種酶類物質(zhì)，如纖維素酶、蛋白酶、糖化酶的產(chǎn)生，使發(fā)酵后的樣品產(chǎn)生更多的還原糖、小肽和氨基酸等物質(zhì)，這些都與發(fā)酵后樣品還原能力的提高有關(guān)。
2.7.2 ABTS＋·清除活性
如圖7所示，米根霉、少孢根霉在發(fā)酵0～18 h時，豆渣的ABTS＋·清除活性均隨著發(fā)酵時間的延長顯著上升，在18 h分別達到3 803.34、4 546.31 μg Trolox/g，相比于未發(fā)酵的豆渣分別提高了1.36、1.63 倍。少孢根霉發(fā)酵豆渣的ABTS＋·清除活性在18 h后趨于穩(wěn)定，而米根霉發(fā)酵豆渣的在18 h后隨著發(fā)酵時間的延長仍有小幅度提高。在30 h時，其ABTS＋·清除活性為4 298.66 μg Trolox/g。ABTS＋·清除能力的不同表明發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化性與其抗氧化物的種類和含量有關(guān)。不同微生物有不同的發(fā)酵特性，因此在發(fā)酵過程中，發(fā)酵產(chǎn)物的種類、比例以及含量都會隨著發(fā)酵時間的進行而變化，因此捕獲自由基的能力可能有變化。
2.7.3 金屬離子螯合能力
如圖8所示，米根霉和少孢根霉發(fā)酵24 h后其水提取物對于Fe2＋螯合能力比未發(fā)酵豆渣有明顯提高，螯合能力分別為3 296.88、3 709.16 μg EDTA-2Na/g，此后隨著發(fā)酵時間的延長稍有降低。已有報道顯示許多傳統(tǒng)發(fā)酵食品，如koji、kinema在發(fā)酵后均能提高其對金屬離子的螯合能力。Pownall等指出一些功能性小肽由于其特殊的肽鏈結(jié)構(gòu)及側(cè)鏈氨基酸，可以阻斷自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，對于螯合過渡態(tài)的金屬離子起著重要的作用。
3討論
用米根霉、少孢根霉為發(fā)酵菌株，以鮮豆渣為原料，純種發(fā)酵制備發(fā)酵豆渣。發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長會引起發(fā)酵基質(zhì)產(chǎn)生大量的生物化學(xué)變化，主要體現(xiàn)在還原糖含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、纖維素酶活力、糖化酶活力和蛋白酶活力都隨著發(fā)酵時間的延長顯著增加，也說明了在發(fā)酵過程中米根霉和少孢根霉能夠在豆渣中較好的生長，將許多大分子物質(zhì)有效分解為易被吸收利用的小分子物質(zhì)，為微生物的后期發(fā)酵提供充足的碳源、氮源。兩種菌株發(fā)酵制得的豆渣其各自的水提取物都表現(xiàn)出較強的還原能力、ABTS＋·清除能力、Fe2＋螯合能力，說明發(fā)酵豆渣與未發(fā)酵豆渣相比，具有更強的抗氧化活性，可以作為氫供體、自由基清除劑以及過氧化金屬離子的螯合劑，為豆渣的功能性食品開發(fā)提供了可能性。
