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導(dǎo)讀

隨著人類生活水平的提高,人們對于優(yōu)質(zhì)蛋白食物的需求量逐漸攀升，從而刺激了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。但是，在養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展過程中，對飼料業(yè)的依賴性也在與日俱增。據(jù)統(tǒng)計，我國的飼料產(chǎn)量供不應(yīng)求，主要靠進(jìn)口解決,預(yù)計到2030年，我國蛋白飼料的缺口將要達(dá)到2790萬噸。而發(fā)酵飼料作為一種新型環(huán)保飼料，已經(jīng)成為當(dāng)今熱點研究方向。通過微生物發(fā)酵手段來發(fā)酵農(nóng)副產(chǎn)物，可以改善產(chǎn)品品質(zhì)以及適口性，且微生物分泌的蛋白酶可分解胰蛋白酶抑制劑等抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高消化吸收率和飼用價值，降低生產(chǎn)成本，減少疾病的發(fā)生，改善飼料對環(huán)境的污染，最終為人類提供全天然無公害營養(yǎng)價值高的飼料產(chǎn)品。目前，微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的發(fā)酵方式已從單一菌種的發(fā)酵趨向于復(fù)合菌株的協(xié)同發(fā)酵，并注重不同微生物之間的協(xié)同性、互補(bǔ)性。由于發(fā)酵產(chǎn)物中含有豐富的維生素、礦物質(zhì)和其他生物活性物質(zhì),將其添加于飼料中，可有效提高畜禽的生長率。此外，固態(tài)發(fā)酵本身成本低，可利用資源豐富,對環(huán)境污染小，在許多方面要優(yōu)于液態(tài)發(fā)酵，現(xiàn)已成為能源開發(fā)的新途徑。

利用50L全自動固體發(fā)酵罐，進(jìn)行復(fù)合菌種發(fā)酵飼料的生產(chǎn)。將四種菌種混合作為發(fā)酵種子液，以玉米粉和豆粕為底料，確定接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、攪拌轉(zhuǎn)速作為參數(shù)，進(jìn)行單因素實驗。最后通過進(jìn)行正交實驗,優(yōu)化發(fā)酵罐生產(chǎn)的最佳工藝條件。

1材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試材料

玉米粉和豆粕（比例2:1)由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.1.2 實驗菌種

復(fù)合菌種:包括植物乳桿菌、納豆芽孢桿菌、釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母。菌種保存于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所實驗室。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基:氯化鈉10.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、蒸餾水1L。121℃滅菌20min。

MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10.0g、牛肉浸粉10.0g、酵母浸粉2g、葡萄糖20.0g、吐溫80 1ml、磷酸氫二鉀2.0g、乙酸鈉5.0g、檸檬酸鈉2.0g、硫酸鎂0.2g、硫酸錳0.05g、蒸餾水1L。115℃滅菌20min。

1.1.4 實驗試劑

蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸粉、氯化鈉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、氫氧化鈉、濃硫酸、濃鹽酸、磷酸二氫鉀、吐溫80、檸檬酸鈉、胰蛋白酶、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸銅、胃蛋白酶、三氯乙酸、硫酸鉀、氯化鉀。所用試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器

MLS - 3780高壓蒸汽滅菌鍋、AUY220 電子分析天平、HZQ -X 100十旦溫振蕩培養(yǎng)箱、Evolution RC高速冷凍離心機(jī)、101A-2 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、HY -04A 高速粉碎機(jī)、BCN -1360B 超凈工作臺、Molgene 1810a 超純水器、HYP - n 消化爐、2300全自動凱氏定氮儀、DELTA320PH 計、55SS-50L 固態(tài)發(fā)酵罐。

1.3 實驗方法

1.3.1 單因素實驗

對可能影響微生物飼料發(fā)酵的主要因素進(jìn)行單因素實驗，主要包括:接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、攪拌轉(zhuǎn)速。通過對發(fā)酵產(chǎn)物中可消化粗蛋白含量的測定，確定影響發(fā)酵的因素。

1.3.2 正交實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，進(jìn)行正交實驗分析，從接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、攪拌轉(zhuǎn)速四個因素中篩選出對發(fā)酵工藝有重要影響的三個參數(shù)，以發(fā)酵樣品中的可消化粗蛋白為指標(biāo),通過正交試驗，對發(fā)酵條件進(jìn)行工藝優(yōu)化。

1.3.3 可消化粗蛋白的測定

體外消化率的測定采用兩步酶法測定。稱量發(fā)酵樣品1g 置于100m L 三角瓶中，加入10mL，0.03g 的胃蛋白酶溶液（pH = 2.0)后，放入搖床中，以37℃、180r/min 恒溫振蕩6h 。取出后，加入少許10mol/ L 的NaOH 溶液，調(diào)節(jié)至中性pH 。加入50mL 、0.025g 的胰蛋白酶（pH = 7.6)后，放入搖床中以37℃、180r/min 恒溫振蕩18h 。取出后，用5% 的三氯乙酸溶液分三次，每次5m L 沖洗三角瓶后，轉(zhuǎn)入100m L 離心管中，離心管先稱重、編號。放入離心機(jī)，4℃、8000g 、離心20min 后取出。取出后，倒出上清液，剩余殘渣及離心管一起放入60℃烘箱中，烘干至恒重，計算殘渣重量。將發(fā)酵殘渣及發(fā)酵樣品一起用凱式定氮儀測定蛋白含量?？上值鞍椎挠嬎惴椒ㄒ妳⒖嘉墨I(xiàn)。

可消化粗蛋白含量計算公式如下：

V1:滴定試樣時所需標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液的體積(mL );

V2:滴定空白時所需標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液的體積(mL );

C :鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mol/L );

m :試樣質(zhì)量(g);

0.014:每毫克當(dāng)量氮的克數(shù)；

6.25:氮換算成蛋白質(zhì)的平均系數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1 接種量對可消化粗蛋白的影響

發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時間3d 、攪拌轉(zhuǎn)速35rpm 時,接種量分別為0.5%、1 % 、1.5 %、2 % 、2.5%時，可消化粗蛋白含量如圖1 所示。由圖1 可知，當(dāng)接種量為0.5 %〜1 % 時，可消化粗蛋白含量隨著接種量的增大而增大;當(dāng)接種量為1 % 時,可消化粗蛋白含量為26.51%;當(dāng)接種量超過1 % 時，可消化粗蛋白含量開始下降，且趨于平穩(wěn)。以節(jié)約成本為前提，在接種量為1%時，發(fā)酵效果最佳。

2.2發(fā)酵溫度對可消化粗蛋白的影響

發(fā)酵條件為接種量為1% 、發(fā)酵時間為3d、攪拌轉(zhuǎn)速為35rpm 時，發(fā)酵溫度分別為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃時，可消化粗蛋白含量如圖2 所示。由圖2 可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為20℃~25℃時，可消化粗蛋白含量趨于平穩(wěn)；當(dāng)發(fā)酵溫度為25℃ ~30℃時，可消化粗蛋白含量隨著發(fā)酵溫度的升高而逐漸上升；當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時，可消化粗蛋白含量為27.83%;當(dāng)發(fā)酵溫度高于30℃時，可消化粗蛋白含量開始隨著發(fā)酵溫度的升高而逐漸下降。原因可能是，隨著發(fā)酵溫度增加，菌體生長速度快，如果發(fā)酵溫度持續(xù)增加，菌體生長過快，易產(chǎn)生衰老，導(dǎo)致菌體自溶使粗蛋白含量降低。所以，當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時，可消化粗蛋白含量最高，發(fā)酵效果最佳。

2.3 發(fā)酵時間對可消化粗蛋白的影響

發(fā)酵條件為接種量為1% 、發(fā)酵溫度為30℃、攪拌轉(zhuǎn)速為35rpm時，發(fā)酵時間分別為1d、2d、3d、4d、5d時，可消化粗蛋白含量如圖3 所示。由圖3 可知：當(dāng)發(fā)酵時間為1d~3d時，可消化粗蛋白含量隨著時間的增加而增加；當(dāng)發(fā)酵時間為3d時，可消化粗蛋白含量為26.78%;當(dāng)發(fā)酵時間超過3d時，可消化粗蛋白含量開始下降。可能是由于時間的增加，發(fā)酵物質(zhì)缺乏，菌體繁殖分解了部分蛋白。所以，當(dāng)發(fā)酵時間為3d時，可消化粗蛋白含量最高，發(fā)酵效果最佳。

2.4 攪拌轉(zhuǎn)速對可消化粗蛋白的影響

發(fā)酵條件為接種量為1% 、發(fā)酵溫度為30℃、發(fā)酵時間為3d時，攪拌轉(zhuǎn)速分別為25rpm、30rpm、35irpm、40rpm、45rpm時，可消化粗蛋白含量如圖4 所示。由圖4 可知：當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為25rpm〜35rpm時，可消化粗蛋白含量隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增加而增加；當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為35rpm時，可消化粗蛋白含量為24.97%;當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速超過35rpm時，隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增加可消化粗蛋白含量減少。原因可能是，轉(zhuǎn)速過高，容易剪切菌絲造成細(xì)胞損傷，形成短矮的分支;轉(zhuǎn)速過低，溶氧供給不足，發(fā)酵變緩。雖然攪拌轉(zhuǎn)速為35rpm時，可消化粗蛋白含量最高，但是如圖4 所示，整條折線變化趨勢平穩(wěn)，差異不明顯。所以攪拌轉(zhuǎn)速可以不作為影響發(fā)酵條件的重要參數(shù)。

2.5 正交實驗

在上述實驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對發(fā)酵條件進(jìn)行工藝優(yōu)化。選擇接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間三個因素作為實驗參數(shù)，進(jìn)行L9(33)三因素三水平的正交實驗，如表1 所示。

正交實驗結(jié)果如表2 所示?？梢?RA> RC> RB，即接種量對發(fā)酵產(chǎn)物的可消化粗蛋白含量影響最為顯著，然后是發(fā)酵時間，而發(fā)酵溫度的影響最小。最佳發(fā)酵條件組合為A2B2C2,即接種量為1 % 、發(fā)酵時間為3d 、發(fā)酵溫度為30℃。此時發(fā)酵產(chǎn)物的可消化粗蛋白含量為29.58%。

3結(jié)果與討論

利用混合菌種進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，可以將非蛋白氮轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，而且菌體分泌的胞外酶可以有效地分解大分子蛋白為小肽和氨基酸,大大提高了可溶性蛋白的含量。由此可見:通過復(fù)合菌種固態(tài)發(fā)酵，可提高飼料的營養(yǎng)價值，有利于動物的消化吸收。在本項工作中，利用單因素實驗,確定了影響發(fā)酵效果的三個參數(shù),分別為接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間。通過正交實驗得到的最佳工藝條件為:接種量1% 、發(fā)酵時間3d 、發(fā)酵溫度30℃。經(jīng)測定，未經(jīng)發(fā)酵的飼料底物中可消化粗蛋白含量為18.83%。在最優(yōu)實驗條件下,發(fā)酵產(chǎn)物中可消化粗蛋白含量為29.58 %，較初始物料提高了 57.09%。