菌酶協(xié)同發(fā)酵改善玉米一豆粕型飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的研究
摘要：研究從枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和乳酸菌中篩選發(fā)酵菌株，在降解飼料抗?fàn)I養(yǎng)因子的基礎(chǔ)上，添加復(fù)合酶制劑，探究菌酶協(xié)同發(fā)酵對(duì)一種玉米一豆粕型飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值改善效果和仔豬飼喂效果。
結(jié)果表明：
1)枯草芽孢桿菌BS12具有較強(qiáng)的抗原蛋白降解能力，糞腸球菌EF有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力；
2)將芽孢桿菌BS12與乳酸菌EF按8：1比例混合，總菌量為1×107CFU／g，添加0.50％的復(fù)合酶制劑，37℃固態(tài)發(fā)酵72h后，飼料中β一伴球蛋白、大豆球蛋白、中性洗滌纖維降解率分別到達(dá)80.74％(P<0.05)、86.87％(P<0.05)和39.36％(P<0.05)，乳酸含量達(dá)到122.57mmol／kg，pH降低至5.0，飼料粗蛋白體外消化率從78.46％提高(P<0.05)至85.77％，蛋氨酸、苯丙氨酸分別提高(P<0.05)15.15％和17.60％，丙氨酸，半胱氨酸，色氨酸分別提高(P<0.05)了10.11％，10.05％和9.89％；
3)使用發(fā)酵飼料替代10％的基礎(chǔ)日糧后，仔豬平均日增重和采食量得到提高。綜上所述，菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料，在提高飼料養(yǎng)分消化率和減少飼用抗生素使用等方面具有良好的應(yīng)用前景。
近年來(lái)，隨著飼用抗生素使用的逐步受限，如何保障畜禽健康成為我國(guó)畜牧業(yè)的一大挑戰(zhàn)。玉米和豆粕是目前仔豬生產(chǎn)上主要的飼料原料，而豆粕中的抗原蛋白、胰蛋白酶抑制劑及植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子會(huì)阻礙消化道吸收利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不利于動(dòng)物生長(zhǎng)和健康。研究表明，生物發(fā)酵能有效降解飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，促進(jìn)養(yǎng)分的消化吸收，改善動(dòng)物健康，減少飼用抗生素(促生長(zhǎng))的使用。選取合適的微生物進(jìn)行飼料的發(fā)酵能有效降解飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，促進(jìn)養(yǎng)分的消化吸收，分泌的代謝產(chǎn)物如小肽，有機(jī)酸等利于改善動(dòng)物健康。
目前乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌被廣泛引用于飼料發(fā)酵。其中，乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸、細(xì)菌素等代謝產(chǎn)物有利于改善飼料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，酵母菌能降解豆粕中的水蘇糖、棉子糖，而枯草芽孢桿菌對(duì)豆粕中抗原蛋白具有較強(qiáng)的降解效果。多菌株混合發(fā)酵理論上可以發(fā)揮不同菌株的發(fā)酵特性，但是不同菌株問存在可能存在拮抗作用，比如，當(dāng)米曲霉和干酪乳桿菌直接混合發(fā)酵豆粕，干乳酪桿菌會(huì)降低米曲霉對(duì)豆粕中抗原蛋白的降解效果。而采用菌酶協(xié)同發(fā)酵，可以提高發(fā)酵過程中微生物對(duì)飼料中大分子物質(zhì)利用效率，如纖維素酶水解秸桿生成的單糖能為酵母菌合成菌體蛋白提供能量，進(jìn)而提高飼料品質(zhì)。
本研究以玉米、豆粕作為主要的發(fā)酵原料，通過單菌固態(tài)發(fā)酵比較不同菌株對(duì)飼料成分及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響。進(jìn)一步采用混菌發(fā)酵和菌酶協(xié)同的方式優(yōu)化飼料的發(fā)酵工藝，制備抗?fàn)I養(yǎng)因子含量低同時(shí)乳酸含量高的生物發(fā)酵飼料。隨后通過仔豬飼喂實(shí)驗(yàn)對(duì)比生物發(fā)酵復(fù)合飼料并將發(fā)酵飼料飼喂仔豬，檢驗(yàn)飼料對(duì)于仔豬生長(zhǎng)性能的影響，為實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。
材料與方法
1 實(shí)驗(yàn)材料
實(shí)驗(yàn)菌株：枯草芽孢桿菌BS12為本研究室自行分離的菌株；
枯草芽孢桿菌CICC20076和枯草芽孢桿菌CICC20070：中國(guó)工業(yè)微生物菌株保藏管理中心(CICC)；
糞腸球菌EF(原始編號(hào)NCIMBl0415)：山東某生物有限公司；
干酪乳桿菌LC和植物乳桿菌LP為本實(shí)驗(yàn)室自行分離的菌株；
釀酒酵母：中國(guó)工業(yè)微生物菌株保藏管理中心(CICC)；
豆粕：浙江某生物發(fā)酵公司。
復(fù)合酶制劑：廣東某酶制劑公司。
主要儀器：Kjeltec 8400
全自動(dòng)凱氏定氮儀：德國(guó)FOSS公司；
L一8900全自動(dòng)氨基酸分析儀：日本Hi-tachi公司；
SpectraMax M5酶標(biāo)儀：美國(guó)MolecularDe—vices公司等。
2 試驗(yàn)方法
2.1 發(fā)酵菌株的篩選
取9g豆粕、9g玉米粉、2g麩皮于100mL 三角瓶中攪拌均勻后配成復(fù)合飼料，于105℃滅菌15min，按接種量5％分別加入枯草芽孢桿菌CICC20076、枯草芽孢桿菌CICC21076、枯草芽孢桿菌BS12、釀酒酵母CICC1520、糞腸球菌EF、干酪乳酸菌LC和植物乳桿菌LP的種子液，同時(shí)加入滅菌水至飼料總含水量為45％，發(fā)酵體系內(nèi)菌濃度達(dá)到1.0×107CFU／g，攪拌均勻后于37℃恒溫培養(yǎng)，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。實(shí)驗(yàn)根據(jù)菌的種類不同共設(shè)7個(gè)組，每組3個(gè)重復(fù)，其中枯草芽孢桿菌CICC20076組、枯草芽孢桿菌CICC21076組和枯草芽孢桿菌BS12組發(fā)酵24 h，釀酒酵母CICC1520組發(fā)酵48 h，糞腸球菌EF組、干酪乳酸菌LC組和植物乳桿菌LP組發(fā)酵48 h。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵飼料于60℃烘干，粉碎過60目篩后，測(cè)定發(fā)酵飼料中粗蛋白、豆粕抗原蛋白、中性洗滌纖維、酸溶蛋白以及乳酸含量。
2.2 混菌發(fā)酵菌株配比優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
將篩選出了芽孢桿菌BS12與糞腸球菌EF以不同比例添加人復(fù)合飼料，添加比如表1所示，按2.1方法先進(jìn)行24h好氧發(fā)酵，再進(jìn)行48h厭氧發(fā)酵，選取最優(yōu)的發(fā)酵比例。
2.3 復(fù)合酶制劑對(duì)纖維降解效果
為彌補(bǔ)細(xì)菌對(duì)纖維降解的不足。本研究中采用復(fù)合酶(主成分為：纖維素酶、甘露糖酶、果膠酶)強(qiáng)化飼料纖維的降解。分別以質(zhì)量比0.3％、0.5％、0.7％和1.0％加入復(fù)合飼料中，隨后經(jīng)過枯草芽孢桿菌BS12和糞腸球菌EF分步發(fā)酵后，測(cè)定發(fā)酵飼料中中性洗滌纖維含量。
2.4 菌酶協(xié)同發(fā)酵對(duì)飼料氨基酸體外消化率的影響
兩步酶法測(cè)定發(fā)酵復(fù)合飼料的體外消化率參考Sakamoto等的方法進(jìn)行。分別取3g發(fā)酵復(fù)合飼料和未發(fā)酵復(fù)合飼料，裝入150mL三角瓶中。加入30mL 10000 U／mL的胃蛋白酶溶液(3000U／mg，Sigma)，用0.05moL／L KCl一HCl緩沖液調(diào)整至pH為2.0，隨后在39℃，150r／min條件下振蕩消化4h。隨后用1moL／L NaOH調(diào)整溶液pH為7.0，加入150mg胰蛋白酶(250 U／mg，Sigma)于39℃，150 r／min繼續(xù)消化4 h。最后加入5 mL 20％的磺基水楊酸溶液終止反應(yīng)，沉淀30 min。消化后的溶液在3000r／min條件下離心15min，棄上清。剩余的殘?jiān)?05℃條件下烘干處理4 h，獲得殘?jiān)鼧颖尽⒄諊?guó)標(biāo)《GB／T 6432—1994》檢測(cè)發(fā)酵前后飼料中的粗蛋白含量，參照國(guó)標(biāo)《GB／T 18246—2000》檢測(cè)殘?jiān)写值鞍缀桶被岬暮俊?/span>
體外消化率按照如下的公式計(jì)算：
3 仔豬飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
3.1 發(fā)酵飼料的制備
玉米、豆粕和麩皮按45％、45％和10％的比例昆合均勻，取200 kg的玉米豆粕復(fù)合飼料，按5％比例分別接種芽孢桿菌BS12、糞腸球菌EF和5％的復(fù)合酶制劑，初始濕度控制在40％左右，室溫條件下(30℃)好氧發(fā)酵24 h后；隨后裝入?yún)捬醢l(fā)酵袋，室溫條件下厭氧發(fā)酵48 h后烘干粉碎待用。
3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
選取192頭體重在(9.35±0.65)kg的49 日齡健康仔豬(Duroc×Large white×Yorkshire)，隨機(jī)分配至兩個(gè)處理組，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)16頭。處理組1飼喂玉米豆粕基礎(chǔ)日糧(對(duì)照組)，日糧中添加100 mg／kg喹乙醇和50 mg／kg吉他霉素；處理組2以10％發(fā)酵飼料替代基礎(chǔ)日糧中的玉米和豆粕(發(fā)酵飼料組)，且日糧中不添加抗生素，實(shí)驗(yàn)期為24 d。于實(shí)驗(yàn)期1 d及24 d稱取仔豬初始體重及末重，每日記錄采食量、計(jì)算平均日增重。實(shí)驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表2。
4 指標(biāo)測(cè)定及方法
飼料中抗原蛋白含量的測(cè)定采用龍科方舟試劑盒根據(jù)酶聯(lián)免疫(ELISA)法進(jìn)行測(cè)定；粗蛋白的測(cè)定參照《GB／T 6432—1994》；粗脂肪的測(cè)定參照《GB／T6433—1994》；中性洗滌纖維的測(cè)定參照《GB／T20806--2006》；飼料中鈣的測(cè)定參照《GB／T6436—2002》；總磷的測(cè)定參照《GB／T6437—2002》；酸溶蛋白的測(cè)定參照Mahmoudreza等的研究；飼料中乳酸采用羥基聯(lián)苯比色法測(cè)定；飼料pH采用pH計(jì)直接測(cè)定。
5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
采用SPSS 19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理，采用ANOVA進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，所有結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
結(jié)果
1 單菌發(fā)酵對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)成分的影響
由表3可知，本實(shí)驗(yàn)中枯草芽孢桿菌對(duì)復(fù)合飼料中的大豆球蛋白和β一伴球蛋白降解程度較強(qiáng)，其中枯草芽孢桿菌BS12的降解能力最高，對(duì)大豆球蛋白降解率為87.40％，β一伴球蛋白為76.60％。除此以外，枯草芽孢桿菌發(fā)酵后，飼料中酸溶蛋白含量高于其他類型的實(shí)驗(yàn)菌株，其中BS12發(fā)酵飼料中酸溶蛋白含量最高，提高了4.8倍。而枯草芽孢桿菌對(duì)飼料中纖維的降解程度也高于其他菌株。其中枯草芽孢桿菌BSl2對(duì)中性洗滌纖維的降解率達(dá)到30.20％。相較于枯草芽孢桿菌和酵母菌，三株乳酸菌(糞腸球菌EF、干酪乳桿菌LC和植物乳桿菌LP)的產(chǎn)乳酸能力較強(qiáng)，其中，糞腸球菌EF最強(qiáng)，發(fā)酵48 h后飼料中乳酸含量達(dá)到110.53 mmol／kg。為了實(shí)現(xiàn)降低飼料抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高飼料乳酸含量的效果，本研究采用枯草芽孢桿菌BS12與糞腸球菌EF進(jìn)行混菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
2 混菌發(fā)酵
如表4所示，枯草芽孢桿菌BS12的比例提高有利于提高飼料中抗原蛋白的降解率和酸溶蛋白的含量。盡管糞腸球菌EF的含量減小，飼料中乳酸含量差異并不顯著。采用當(dāng)飼料中總菌量達(dá)到1.0×107CFU／g，芽孢桿菌BS12和糞腸球菌比例8：1時(shí)，進(jìn)行先好氧發(fā)酵24 h，再厭氧發(fā)酵48 h，飼料中大豆球蛋白含量減少至8.31 mg／g，β一伴球蛋白含量降低至6.44mg／g，酸溶蛋白相較發(fā)酵前提高6.16倍，乳酸含量達(dá)到116.57 mg／g。
3 菌酶協(xié)同發(fā)酵對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)成分的影響
由表5可知，添加纖維素酶、甘露糖酶及果膠酶制備的后，發(fā)酵飼料中性洗滌纖維降解程度提高。添加量為0.30％、0.50％、0.70％和1.00％時(shí)，相較于未發(fā)酵飼料，中性洗滌纖維降解率分別為35.41％、39.36％、40.32％和40.61％。但是抗原蛋白降解程度及乳酸含量變化并不顯著。
4 茵酶協(xié)同發(fā)酵對(duì)飼料氨基酸消化率的影響
由圖1可見，經(jīng)過發(fā)酵后，飼料中粗蛋白消化率也得到提高，6種必需氨基酸和5種非必須氨基酸體外消化率得到顯著提高。其中，蛋氨酸、苯丙氨酸分別提高15.15％和17.60％，丙氨酸，半胱氨酸，色氨酸分別提高了10.11％、10.05％和9.89％，粗蛋白消化率整體提高6.94％。
5 仔豬飼喂效果
由表6可知，相較于添加抗生素的對(duì)照組，飼料中添加10％的發(fā)酵飼料有利于提高采食量和日增重。較于對(duì)照組，發(fā)酵飼料組仔豬料肉比和腹瀉率相差異并不顯著。
通過生物發(fā)酵降低飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，從而提高動(dòng)物對(duì)飼料養(yǎng)分的消化利用率，已成為飼料工業(yè)發(fā)展的重要方向。目前研究多為發(fā)酵單一原料，如發(fā)酵豆粕、發(fā)酵菜粕和發(fā)酵DDGS。但是對(duì)于混合原料發(fā)酵的研究并不充分。本研究以玉米、豆粕和麩皮配制成混合原料，采用枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、糞腸球菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，通過比較不同菌株對(duì)飼料中抗原蛋白降解程度、纖維降解程度及發(fā)酵后飼料中乳酸含量的影響，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對(duì)飼料原料中蛋白和纖維的降解程度更高，乳酸菌產(chǎn)乳酸能力更強(qiáng)。Chi等也發(fā)現(xiàn)相較于酵母菌和乳酸菌，解淀粉芽孢桿菌對(duì)豆粕蛋白的降解程度更高。這可能是由于芽孢桿菌能分泌大量蛋白酶和纖維素酶，對(duì)大分子蛋白和纖維降解能力較強(qiáng)。乳酸菌雖然可以發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，但是在固態(tài)發(fā)酵中對(duì)飼料中抗原蛋白的降解能力不強(qiáng)。
本研究通過發(fā)酵實(shí)驗(yàn)篩選了1株高效降解豆粕抗原蛋白的枯草芽孢桿菌BS12和1株產(chǎn)乳酸能力較強(qiáng)的糞腸球菌EF，用于玉米豆粕型復(fù)合飼料的發(fā)酵。結(jié)果顯示，將BS12與EF按總菌量1.0x 107CFU／g，菌量比8：1接種于復(fù)合飼料，同時(shí)接入5％的復(fù)合酶，發(fā)酵72 h，可降解飼料中80％的大豆抗原蛋白，且乳酸含量達(dá)到122.18 mmol／kg。所得發(fā)酵復(fù)合飼料提高了仔豬采食量和日增重，有利于提高仔豬生長(zhǎng)性能，減少飼用抗生素使用。
發(fā)酵完成的棉菜粕飼喂動(dòng)物技術(shù)
需要注意的是，發(fā)酵后的飼料酸度較低，不可以取代禽畜全部日糧。其他類發(fā)酵飼料同理。飼喂時(shí)根據(jù)不同情況，將發(fā)酵飼料按照一定比例添加到日糧中，發(fā)酵完成的棉菜粕為濕料，具體使用量每大概1.5-2公斤發(fā)酵棉菜粕（濕料）代替動(dòng)物日糧配方中1公斤豆粕的使用量進(jìn)行代替使用，與其它飼料混合后直接飼喂，由于棉菜籽粕蛋白較高，最高使用量不要超過禽畜日糧飼喂量的40%（濕料重量）。如果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵飼料過酸適口性變差，可在飼喂前在陽(yáng)光下曬1-2小時(shí)，或添加適量的碳酸氫鈉（小蘇打）即可改善。
發(fā)酵過程中與發(fā)酵后使用過程中，發(fā)酵的容器要一直保持密封狀態(tài)，可以長(zhǎng)時(shí)間保存（一年左右）。
當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)成本高居不下，而飼料成本是其中最高的，利用廉價(jià)原料發(fā)酵飼料（包括一些輕度發(fā)霉的粕類低價(jià)收回）是極佳解決辦法。通過微生物飼料發(fā)酵劑的發(fā)酵作用，可以將輕度霉變飼料變成優(yōu)質(zhì)飼料，將不易消化的物質(zhì)分解為可被畜禽吸收的小分子糖類、氨基酸等。同時(shí)發(fā)酵飼料中富含有益微生物、酶制劑、酸化劑等，可調(diào)節(jié)畜禽腸胃微生態(tài)環(huán)境并進(jìn)一步提高飼料利用率。發(fā)酵飼料氣味清香，提高了飼料的適口性，加上發(fā)酵飼料中有大約4℃的酒度，能夠促進(jìn)動(dòng)物新陳代謝促進(jìn)健康抵御疾病，是當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中重要的一環(huán)。
本技術(shù)也可以同樣發(fā)酵菜籽粕（餅）、棕櫚粕等，方法同上。
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2020年已全面禁抗，我們之前經(jīng)常在飼料中添加的抗生素進(jìn)行促生長(zhǎng)行為將是違法，否則面臨巨額罰單。如何既能夠促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)又能夠形成無(wú)抗養(yǎng)殖呢？其實(shí)中草藥在促進(jìn)畜禽養(yǎng)殖健康和生長(zhǎng)、改善肉蛋奶品質(zhì)大有可為，特別是將中草藥發(fā)酵后效果提升4-28倍等好處，這個(gè)實(shí)施方案比你想象中效果更好，運(yùn)用的沒有不被效果折服的，值得嘗試驗(yàn)證
我們的技術(shù)僅需在出欄前半個(gè)月左右運(yùn)用益生菌+酶制劑+中草藥相關(guān)的無(wú)違禁安全產(chǎn)品，肉質(zhì)改善非常顯著，且可以批量化生產(chǎn)。
目前我們已經(jīng)有了成熟的技術(shù)、產(chǎn)品和運(yùn)用方案，且有大量成功案例，可以在短時(shí)間、批量化、安全無(wú)違禁地為您的養(yǎng)殖場(chǎng)生產(chǎn)出高品質(zhì)的家畜、家禽、水產(chǎn)產(chǎn)品。
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