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微生態(tài)制劑對(duì)圍產(chǎn)期牦牛瘤胃微生物及發(fā)酵功能的影響

2020-06-15 09:26:10      點(diǎn)擊:

摘 要:試驗(yàn)旨在研究微生態(tài)制劑對(duì)圍產(chǎn)期牦牛血液生化、瘤胃微生物區(qū)系和瘤胃發(fā)酵功能的影響。將20頭牦牛,按照年齡、體重、胎次及生理狀態(tài)相近的配對(duì)原則,分為對(duì)照組和處理組(微生態(tài)制劑),飼喂期42d,在不同日齡收集血清和瘤胃液。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,微生態(tài)制劑可以降低血液中β-羥丁酸(BHBA)濃度和瘤胃液中乳酸濃度,增加瘤胃液中丙酸濃度;顯著增加瘤胃液中反芻月形單胞菌和棲瘤胃普雷沃氏菌數(shù)量,降低黃色瘤胃球菌數(shù)量。研究表明,微生態(tài)制劑通過影響圍產(chǎn)期牦牛瘤胃微生物,可以改善牦牛瘤胃發(fā)酵功能和產(chǎn)后代謝紊亂。

瘤胃是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng),反芻動(dòng)物采食的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過發(fā)酵過程被消化,發(fā)酵過程由各種微生物如細(xì)菌、原生動(dòng)物和真菌執(zhí)行。為了提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)效率,微生態(tài)制劑等飼料添加劑常用來改善反芻動(dòng)物的發(fā)酵功能。此外,微生態(tài)制作為飼料添加劑在動(dòng)物飼喂中主要作用是改善動(dòng)物生產(chǎn)性能,并在單胃動(dòng)物和水生動(dòng)物中取得了良好的效果。微生態(tài)制劑可調(diào)節(jié)瘤胃微生態(tài)環(huán)境,促進(jìn)幼齡反芻動(dòng)物瘤胃功能的完善,提高瘤胃pH值和揮發(fā)性脂肪酸濃度,但在反芻動(dòng)物中研究相對(duì)較少,特別是牦牛。因此,本試驗(yàn)通過在日糧中添加微生態(tài)制劑,研究微生態(tài)制劑對(duì)圍產(chǎn)期牦牛血清生化、瘤胃發(fā)酵功能、瘤胃微生物區(qū)系的影響,為微生態(tài)制劑在牦牛生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

微生態(tài)制劑由本實(shí)驗(yàn)室前期制備,制備方法為真空干燥法,主要成分為釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、伯頓畢赤酵母、反芻月形單胞菌和埃氏巨型球菌,含活菌總數(shù)大于2×109CFU/g。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及日糧

在拉薩市林周縣選擇體重、體況相似、健康、處于妊娠中期的牦牛20頭,按照年齡、體重、胎次及生理狀態(tài)相近的配對(duì)原則將其分為對(duì)照組與復(fù)合微生態(tài)制劑飼喂組(以下簡(jiǎn)稱飼喂組),每組10頭,基礎(chǔ)口糧相同,對(duì)照組不飼喂,飼喂組牦牛每頭每天飼喂5g復(fù)合微生態(tài)制劑,飼喂期42d。微生態(tài)制劑飼喂方式為精飼料中混合飼喂。試驗(yàn)日糧包括精料和粗料,單頭飼喂,每日2次,自由飲水。精料成分根據(jù)NRC(2000)肉牛營(yíng)養(yǎng)需要和中國(guó)肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(2013)設(shè)計(jì),補(bǔ)充精料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

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1.3 瘤胃液和血液的采集與處理

圍產(chǎn)期牦牛分別在分娩-21、-14、-7、1、7、14和21d,于晨飼后4和8h從牛瘤胃腹囊下部抽取瘤胃液,每次采集約50mL,將所采集的瘤胃液混合。采集的瘤胃液用四層紗布過濾,取30mL濾液于液氮中凍存,用于檢測(cè)細(xì)菌數(shù)量及種類。剩余的濾液經(jīng)3500r/min離心10min,取上清液于-20℃凍存,用于檢測(cè)pH值、氨態(tài)氮、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸。從牦牛靜脈采集5mL血液于肝素鈉管中,3500r/min離心5min,取血清,放置于-80℃凍存,用于檢測(cè)各種生化指標(biāo)。

1.4 血清生化指標(biāo)的測(cè)定

測(cè)定的血清生化指標(biāo)包括:血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、甘油三脂(TG)、總膽固醇(CHO)、尿素氮(BUN)、肌酐酸(CRE)、谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶采用全自動(dòng)生化分析儀(日立7170s全自動(dòng)生化分析儀)進(jìn)行測(cè)定。球蛋白(GLO)測(cè)定采用試劑盒(南京建成生物有限公司)利用免疫比濁法進(jìn)行測(cè)定,β-羥丁酸測(cè)定采用試劑盒(南京建成生物有限公司)利用免疫比濁法進(jìn)行測(cè)定。

1.5 瘤胃液指標(biāo)的測(cè)定

瘤胃液pH值采用pH計(jì)測(cè)定,瘤胃液中氨態(tài)氮采用比色法測(cè)定,乙酸、丙酸、丁酸、乳酸根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)法使用water-baseline 810液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。

1.6 瘤胃微生物水平的測(cè)定

細(xì)菌總DNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司細(xì)菌DNA提取試劑盒,操作方法按照說明書進(jìn)行,采用NanoDrop one(Thermo Fisher Scientific)測(cè)定DNA濃度。以細(xì)菌總DNA為模板,采用熒光定量PCR檢測(cè)瘤胃乳酸桿菌、牛鏈球菌、反芻月形單胞菌、埃氏巨型球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、嗜淀粉瘤胃細(xì)菌、溶纖維丁酸弧菌、布氏普雷沃氏菌、普雷沃氏短桿菌、棲瘤胃普雷沃氏菌、厭氧弧桿菌的水平。引物序列參考NCBI中各菌種序列設(shè)計(jì),引物序列如表2所示,細(xì)菌數(shù)量的相對(duì)表達(dá)水平以真細(xì)菌校正后進(jìn)行分析,分析方法參考Berglund等的方法。

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1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用EXCEL 2016初步統(tǒng)計(jì)后,使用SPSS 19.0進(jìn)行顯著性檢測(cè)分析,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,P<0.05表示差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1 微生態(tài)制劑對(duì)牦牛血液生化指標(biāo)的影響(見表3~表5)

由表3可知,在圍產(chǎn)期不同時(shí)點(diǎn),總蛋白和球蛋白水平在產(chǎn)后顯著增加(P<0.05),但是微生態(tài)制劑飼喂沒有影響,兩者無交互作用。在對(duì)照組和微生態(tài)制劑組中,與圍產(chǎn)期-21d相比,不同時(shí)間點(diǎn)白蛋白、堿性磷酸酶、尿素氮、肌酐酸、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶濃度差異不顯著(P>0.05)。

由表4、表5可知,對(duì)照組和微生態(tài)制劑組中血清中葡萄糖在圍產(chǎn)前期增加,產(chǎn)后下降至正常水平,甘油三酯濃度在圍產(chǎn)期下降,膽固醇濃度則先下降后增加至正常水平。然而在微生態(tài)組中β-羥丁酸濃度則下降,且差異顯著(P=0.039)。

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2.2 微生態(tài)制劑對(duì)瘤胃發(fā)酵功能的影響(見表6、表7)

由表6、表7可知,對(duì)照組和微生態(tài)制劑組pH值和氨態(tài)氮水平均無顯著差異(P>0.05);對(duì)照組和微生態(tài)制劑組乙酸水平均無顯著差異(P>0.05),但微生態(tài)制劑可增加產(chǎn)后乙酸濃度(P=0.083);圍產(chǎn)期內(nèi)丙酸濃度無顯著差異,但微生態(tài)制劑可以顯著增加產(chǎn)后丙酸的濃度(P=0.034);圍產(chǎn)期內(nèi)丁酸濃度無顯著變化,同時(shí)微生態(tài)制劑對(duì)丁酸濃度也無影響;在產(chǎn)后,瘤胃內(nèi)乳酸濃度在對(duì)照組和微生態(tài)制劑組顯著增加(P=0.013,P=0.048),與對(duì)照組相比,微生態(tài)制劑降低瘤胃液中乳酸濃度(50%)。

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2.3 微生態(tài)制劑對(duì)瘤胃微生物的影響(見表8)

由表8可知,對(duì)照組中,乳酸桿菌數(shù)量在產(chǎn)后1d最高,隨后下降,但差異不顯著(P>0.05),微生態(tài)制劑組沒有變化。對(duì)照組中,韋榮球菌科的反芻月形單胞菌和埃氏巨型球菌數(shù)量沒有顯著變化,但微生態(tài)制劑組的反芻月形單胞菌顯著增加(P<0.05)。纖維桿菌門中,琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量在對(duì)照組在產(chǎn)后1d最高,隨后下降,但差異不顯著,微生態(tài)制劑組中則在產(chǎn)后保持相同水平。瘤胃球菌科中,對(duì)照組白色瘤胃球菌數(shù)量呈先下降后增加,而微生態(tài)制劑組則在圍產(chǎn)期內(nèi)保持增加但差異不顯著;對(duì)照組黃色瘤胃球菌數(shù)量無顯著變化,微生態(tài)制劑組顯著下降。圍產(chǎn)期內(nèi)對(duì)照組和微生態(tài)制劑組的嗜淀粉瘤胃菌數(shù)量顯著增加,但微生態(tài)制劑沒有影響。對(duì)照組的溶纖維丁酸弧菌數(shù)量呈先增加后下降,而在微生態(tài)制劑組則無變化。普雷沃氏菌科中,布氏普雷沃氏菌數(shù)量在對(duì)照組和微生態(tài)制劑組均下降,但差異不顯著;普雷沃氏短桿菌數(shù)量在對(duì)照組中增加,但微生態(tài)制劑組呈先增加后下降。棲瘤胃普雷沃氏菌數(shù)量在對(duì)照組呈先增加后下降,而微生態(tài)制劑組則顯著增加。厭氧弧桿菌數(shù)量在對(duì)照組和微生態(tài)制劑組顯著增加,但兩組間差異不顯著。

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3討 論

血液中GLU濃度是動(dòng)物機(jī)體能量代謝水平的重要體現(xiàn),而GLU來源主要包括揮發(fā)性脂肪酸為前體物的合成和瘤胃內(nèi)淀粉的分解吸收,在圍產(chǎn)期前后GLU水平的變化體現(xiàn)了動(dòng)物對(duì)GLU合成與利用能力的變化,本研究中微生態(tài)制劑對(duì)GLU濃度沒有影響,與Hassan等的結(jié)果不相同,但與Norton的研究結(jié)果類似,可能由于添加劑與物種之間的差異。TP包括GLO和ALB,在圍產(chǎn)期內(nèi)呈現(xiàn)規(guī)律性變化,表明在產(chǎn)后由于泌乳的蛋白需要,體內(nèi)蛋白合成代謝受到影響,而微生態(tài)制劑對(duì)圍產(chǎn)期牦牛的蛋白代謝無影響,這與楊朋飛的結(jié)果不同,但與Stella等的研究結(jié)論一致。在泌乳過程中由乳腺合成乳脂肪是前體物之一是β-羥丁酸,而高濃度的β-羥丁酸會(huì)抑制乳腺細(xì)胞中脂肪的合成。本試驗(yàn)中,微生態(tài)制劑顯著降低產(chǎn)后血液中β-羥丁酸的濃度,表明可能對(duì)糖脂代謝有一定的影響。而在圍產(chǎn)期內(nèi)TG和TC的水平同樣呈規(guī)律性的變化,但微生態(tài)制劑并無顯著影響,表明微生態(tài)制劑可能通過糖異生途徑影響脂肪代謝過程。微生態(tài)制劑對(duì)血液中肌酐酸、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶濃度無顯著影響,表明飼喂微生態(tài)制劑對(duì)圍產(chǎn)期牦牛機(jī)體健康未產(chǎn)生不良影響。

瘤胃內(nèi)環(huán)境發(fā)酵機(jī)能是反映牛消化代謝狀況的重要指標(biāo),由于在圍產(chǎn)期內(nèi)飼糧組分的變化,瘤胃內(nèi)微生物種類和數(shù)量產(chǎn)生快速變化,同時(shí)在產(chǎn)后為了維持乳液的分泌,牛體內(nèi)能量動(dòng)員易引起圍產(chǎn)期代謝紊亂。發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸吸收后通過糖異生或直接氧化供能方式參與動(dòng)物機(jī)體的供能,丙酸則是主要的生糖前質(zhì)。瘤胃液中pH值會(huì)影響瘤胃內(nèi)微生物菌群組成,保持穩(wěn)定的瘤胃液pH值對(duì)瘤胃發(fā)酵功能至關(guān)重要,而pH值主要受飼糧結(jié)構(gòu)引起的發(fā)酵模式的影響。本研究中,圍產(chǎn)期內(nèi)pH值、氨態(tài)氮、乙酸、丙酸、丁酸水平?jīng)]有變化,但乳酸水平顯著增加,這與奶牛中的變化相同。微生態(tài)制劑飼喂增加瘤胃液中乙酸和丙酸的水平,并降低乳酸水平,對(duì)pH值、氨態(tài)氮和丁酸濃度無影響,結(jié)果與酮病奶牛和亞急性、急性瘤胃酸中毒的奶牛添加微生態(tài)制劑結(jié)果相同。泌乳奶牛飼喂釀灑酵母也可以增加瘤胃液中丁酸的濃度。瘤胃液中乳酸濃度過高是由于相應(yīng)產(chǎn)乳酸產(chǎn)生菌過量增殖產(chǎn)生的,而過多乳酸會(huì)引起瘤胃酸中毒導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂。圍產(chǎn)期內(nèi)牦牛瘤胃液中乳酸水平增加,微生態(tài)制劑可以顯著減少乳酸水平并增加乙酸和丙酸的水平,說明微生態(tài)制劑可能通過增加乳酸的利用,增加丙酸等生糖前體的供給,改善圍產(chǎn)期的代謝紊亂。

瘤胃發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量和數(shù)量取決于瘤胃微生物的種類和活性,瘤胃微生物生態(tài)系統(tǒng)非常多樣化。反芻月形單胞菌和埃氏巨型球菌是瘤胃中主要的丙酸生成菌,也是發(fā)酵乳酸生成揮發(fā)性脂肪的優(yōu)勢(shì)菌,其中反芻月形單胞菌占瘤胃總細(xì)菌數(shù)量的51%。本研究中,微生態(tài)制劑可以顯著增加反芻月形單胞菌數(shù)量,但對(duì)埃氏巨型球菌數(shù)量沒有影響。Nisbet等研究表明,日糧中添加啤酒酵母可以增加瘤胃中反芻月形單胞菌數(shù)量,進(jìn)而增加瘤胃中揮發(fā)性脂肪酸的濃度,尤其是丙酸的濃度。瘤胃中70%的乳酸是由埃氏巨型球菌發(fā)酵分解,并以丙酸為最終產(chǎn)物。產(chǎn)后奶牛灌服埃氏巨型球菌可以改變發(fā)酵方式,顯著增加瘤胃中揮發(fā)性脂肪酸的濃度,尤其是丙酸的濃度,改善機(jī)體的代謝。但本研究中,微生態(tài)制劑對(duì)圍產(chǎn)期瘤胃中埃氏巨型球菌沒有影響。在體外試驗(yàn)中,白色瘤胃球菌生長(zhǎng)過程中會(huì)分泌出一些抑制因子,對(duì)黃色瘤胃球菌的增殖起到排斥作用,但當(dāng)環(huán)境內(nèi)反芻月形單胞菌占優(yōu)勢(shì)時(shí),黃色瘤胃球菌即會(huì)表現(xiàn)出更明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。而本研究中黃色瘤胃球水平降低,可能是白色瘤胃球菌和反芻月形單胞菌共同作用的結(jié)果。棲瘤胃普雷沃氏菌是瘤胃中的優(yōu)勢(shì)菌群,它在瘤胃中是數(shù)量最多的蛋白質(zhì)降解菌,表明微生態(tài)制劑可能對(duì)瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)的消化代謝產(chǎn)生影響。

4結(jié)論

圍產(chǎn)期牦牛飼喂微生態(tài)制劑可以降低血液中β-羥丁酸濃度;降低瘤胃液中乳酸濃度,增加丙酸濃度;顯著增加芻月形單胞菌種棲瘤胃普雷沃氏菌數(shù)量,降低黃色瘤胃球菌數(shù)量。

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