1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品

實(shí)驗(yàn)室保藏芽孢桿菌菌株，篩選自養(yǎng)殖場土壤、畜禽糞便等樣品。

1.1.2 試驗(yàn)菌株

大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、痢疾桿菌（Shigella Castellani）由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L、瓊脂1.5%~2.0%，pH值7.2~7.4。NB培養(yǎng)基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L，pH值7.2~7.4。發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化鈉8.5g/L、磷酸二氫鉀1g/L、葡萄糖1g/L。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L，pH值7.2。

1.2 菌株初篩

活化大腸桿菌菌種，并制備發(fā)酵液。將大腸桿菌培養(yǎng)液按1%的比例加到NA培養(yǎng)基中，充分混勻倒板，制成大腸桿菌病原菌平板。將實(shí)驗(yàn)室4℃冰箱保藏的單菌落菌株，采用十字劃線法接種到大腸桿菌平板上，37℃培養(yǎng)觀察其對(duì)大腸桿菌的拮抗情況。

1.3 菌株復(fù)篩

在初篩獲得的菌株中，為了排除是生長競爭所導(dǎo)致大腸桿菌沒有生長，采取平板擴(kuò)散法進(jìn)行復(fù)篩，觀察抑菌圈直徑。參照1.2和1.3的方法，將復(fù)篩得到的菌株依次用于沙門氏菌和痢疾桿菌拮抗菌的篩選，綜合對(duì)3株病原菌的抑菌能力優(yōu)選出3株拮抗菌進(jìn)行后續(xù)研究。

1.4 功能菌株的種屬鑒定

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。通過16SrDNA序列分析進(jìn)行分子學(xué)鑒定，通過測序結(jié)果進(jìn)行同源性比較，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，初步確定種屬地位。

1.5 功能菌株的性質(zhì)研究

1.5.1 功能菌株在不同pH值下的生長情況

制備功能菌株種子液，以1%的接種量轉(zhuǎn)接于pH值為3.5、4.5、5.5、6.5的100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中。37℃、180r/min培養(yǎng)48h，測定發(fā)酵液在600nm下的吸光值。

1.5.2 功能菌株在不同溫度下的生長情況

制備功能菌株種子液，以1%的接種量轉(zhuǎn)接于100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在27、37、47℃，180r/min培養(yǎng)48h，測定發(fā)酵液在600nm下的吸光值。

1.5.3 功能菌株在不同膽鹽濃度下的生長情況

制備功能菌株種子液，以1%的接種量轉(zhuǎn)接于膽鹽濃度分別為0、0.15、0.30、0.60g/L的100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、180r/min培養(yǎng)48h，測定發(fā)酵液在600nm下的吸光值。

1.6 功能菌株產(chǎn)消化酶情況

1.6.1 菌株產(chǎn)蛋白酶情況

通過平板擴(kuò)散法將菌株發(fā)酵液離心上清液加入添加了10%脫脂奶粉的LB平板中，37℃培養(yǎng)觀察是否有水解圈。

1.6.2 菌株產(chǎn)淀粉酶情況

通過平板擴(kuò)散法將菌株發(fā)酵液離心上清液加入添加了1%淀粉的LB平板中，37℃培養(yǎng)48h，加入碘液觀察是否有水解圈。

1.6.3 菌株產(chǎn)纖維素酶情況

通過平板擴(kuò)散法將菌株發(fā)酵液離心上清液加入剛果紅平板中，37℃培養(yǎng)48h觀察是否有水解圈。

1.6.4 菌株產(chǎn)脂肪酶情況

通過平板擴(kuò)散法將菌株發(fā)酵液離心上清液加入添加了1%三丁酸甘油酯的平板中。37℃培養(yǎng)72h觀察是否出現(xiàn)水解圈。

2結(jié)果與分析

AGP作為一種非營養(yǎng)型的飼料添加劑，在促進(jìn)動(dòng)物生長，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能方面起著積極的作用，但是長期使用抗生素，會(huì)使病菌的抗藥性增強(qiáng)，從而造成不同程度的感染。近年來，細(xì)菌耐藥性等問題日益突出，無毒、無公害的微生態(tài)飼料添加劑的研究和開發(fā)顯得日益重要。隨著人們對(duì)更安全、優(yōu)質(zhì)的畜禽產(chǎn)品的追求，無抗養(yǎng)殖成為大勢所趨，發(fā)酵飼料將起著非常重要的作用。目前，用于發(fā)酵飼料的添加劑有酸化劑、益生菌、酶制劑等物質(zhì)，其中益生菌具有促進(jìn)動(dòng)物腸道有益菌群的形成等優(yōu)勢，受到廣泛好評(píng)。近幾年，研究發(fā)現(xiàn)益生菌也可以直接添加到飼料中，操作簡便、成本較低廉、不會(huì)破壞飼料中的營養(yǎng)成分，還能提高飼料報(bào)酬，確保畜牧業(yè)安全生產(chǎn)，同時(shí)提高了經(jīng)濟(jì)效益。芽孢桿菌所進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化法能夠產(chǎn)生抑制大腸桿菌生長的益生作用，抑制有害病原菌的生長和增強(qiáng)抵抗疾病的能力，可以廣泛應(yīng)用于畜牧行業(yè)中。

本研究得到的3株益生芽孢桿菌可以拮抗3種腸道病原菌的生長，并且可以耐受胃酸和膽鹽的環(huán)境，這樣就可以保證菌株隨著發(fā)酵飼料進(jìn)入腸道后有定植的可能，進(jìn)一步發(fā)揮抗病的功能。近年來，一些真菌、細(xì)菌的代謝產(chǎn)物被證實(shí)能夠起到益生作用，但大部分不可以直接加入飼料中對(duì)牲畜直接投喂，其提取產(chǎn)物的過程較為復(fù)雜、成本高。動(dòng)物飼料中添加各種酶有利于動(dòng)物生產(chǎn)，因?yàn)槊缚梢詭椭暳希嵘暳蠄?bào)酬，故酶制劑在動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛。利用飼用益生菌本身產(chǎn)酶特性制備微生態(tài)制劑，在動(dòng)物消化也可起到重要作用。本研究得到的3株芽孢桿菌均可以產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶，具備益生菌的潛質(zhì)。芽孢桿菌可以形成芽孢體，抗逆性強(qiáng)，有利于產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝和貯藏，進(jìn)而保證產(chǎn)品的質(zhì)量。本研究得到的菌株可以在不同的溫度生長，并且可以耐受較低的pH值環(huán)境，這樣就能解決菌株的干燥不耐高溫和倉儲(chǔ)期短的問題。因此，本研究篩選到的芽孢桿菌可以很好地應(yīng)用于發(fā)酵飼料中，能達(dá)到減抗、替抗的效果，尤其是菌株B-1d為枯草芽孢桿菌，在飼料添加劑的目錄中，可直接用于畜禽行業(yè)。