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隨著我國飼料資源的日趨緊張及抗生素的禁用，積極尋找健康多元化的飼料資源及安全高效的飼料生產(chǎn)模式，成為了畜牧工作者亟待解決的首要任務(wù)。發(fā)酵飼料作為一種新型、綠色的環(huán)境友好型飼料，制作過程中有益微生物大量繁殖，可將飼料中蛋白質(zhì)分解為氨基酸及小分子的肽，淀粉分解發(fā)生糖化、酸化，兼?zhèn)湮⑸鷳B(tài)制劑、酶及糖化處理的功能。然而，發(fā)酵飼料在畜禽上應(yīng)用的研究結(jié)果并非十分一致。大多研究表明，發(fā)酵飼料對(duì)畜禽日增重、飼料轉(zhuǎn)化效率、免疫功能及腸道健康等方面均體現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用。另有結(jié)果顯示，飼料中蛋白質(zhì)經(jīng)發(fā)酵脫羧產(chǎn)生生物胺，其過度積累將導(dǎo)致飼料適口性降低及氨基酸的不可逆損失。發(fā)酵飼料制作工藝的不同，是其飼用效果呈現(xiàn)多樣性的重要原因，亦是其功能性評(píng)價(jià)成敗的關(guān)鍵。因此，本試驗(yàn)采用固體發(fā)酵工藝制備固態(tài)發(fā)酵醋糟飼料(solid-state fermentation vinegar dregs，SFVD)，并研究其對(duì)育肥豬生長性能、養(yǎng)分表觀消化率、血清指標(biāo)及糞便中揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids，VFAs)含量的影響，以期為新型生物飼料的研發(fā)與應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。

1  材料與方法

1.1  試驗(yàn)材料

發(fā)酵菌種:布拉式酵母菌(Saccharomyces bou lardji)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)及地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)均由北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司提供。

胰蛋白胨、酵母提取物購于英國 Oxoid 公司，氯化鈉(NaCl)、葡萄糖購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基(MＲS 培養(yǎng)基)購于北京奧博星生物技術(shù)有限公司。溶菌肉湯培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基)組成見表 1。

1.2  試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

選擇體況相近［(59.04±0.33)］kg 的健康“杜 × 長 × 大”三元雜交育肥豬 60 頭，隨機(jī)分為 2 個(gè)組，每組 3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù) 10 頭豬，各重復(fù)間初始體重差異不顯著(P ＞ 0.05)?；A(chǔ)飼糧參考NＲC(2012)營養(yǎng)需要配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表 2.對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧 +150 mg /kg 土霉素鈣，試驗(yàn)組飼喂基礎(chǔ)飼糧 +5%的 SFVD。自由采食和飲水，預(yù)試期 6 d，正試期 35 d。

試驗(yàn)開始前對(duì)豬舍進(jìn)行全面清掃、消毒，試驗(yàn)期間每周進(jìn)行 1 次豬舍消毒。豬舍內(nèi)環(huán)境溫度維持在 20～25 ℃，相對(duì)濕度為 65%。豬只管理和免疫按常規(guī)進(jìn)行。動(dòng)物試驗(yàn)于 2018 年 12 月 6 日至2019 年 1 月 10 日在重慶市畜牧科學(xué)院動(dòng)物營養(yǎng)研究所進(jìn)行。

1.3  SFVD 的配制

據(jù)課題組前期研究結(jié)果，試驗(yàn)對(duì) SFVD 制備工藝進(jìn)一步優(yōu)化:植物乳桿菌、地衣芽孢桿菌及布拉式酵母菌液分別接種于液體 MＲS(37 ℃靜置培養(yǎng) 16 h)、LB(37 ℃、220 r/min 培養(yǎng) 16 h)和 YPD培養(yǎng)基(30 ℃、200 r/min 培養(yǎng) 24 h)培養(yǎng)后，分別以 1%接種量接種于發(fā)酵罐中，控制罐壓、通氣量、溶氧、pH 及溫度等條件。裝袋密封，室溫厭氧發(fā)酵 5 d。飼料需于開袋后 15 d 內(nèi)使用完畢，隨用隨取，隨取隨封，嚴(yán)防二次發(fā)酵及霉菌污染。發(fā)酵菌種的培養(yǎng)均采用先搖瓶、后發(fā)酵罐的擴(kuò)繁模式。發(fā)酵罐容積 50 L，植物乳桿菌和地衣芽孢桿菌培養(yǎng)基添加量為 35 L /罐，布拉式酵母菌培養(yǎng)基添加量為 30 L /罐。布拉式酵母菌培養(yǎng)過程中，當(dāng)溶氧解含 量 開 始 回 升 時(shí)，補(bǔ)料5 L，流 速 控 制 為30 mL /(h•L)。菌種的培養(yǎng)工藝詳見表 3，生物飼料組成及營養(yǎng)水平見表 4。

1.4  樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

1.4.1  生長性能測(cè)定

每天記錄仔豬采食量，試驗(yàn)前后對(duì)仔豬進(jìn)行稱重，并根據(jù)以上數(shù)據(jù)計(jì)算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.4.2  常規(guī)養(yǎng)分含量的測(cè)定

糞樣、飼料樣中的干物質(zhì)( DM ) 含量采用105 ℃烘干法(GB /T 6435—2006)測(cè)定，粗蛋白質(zhì)(CP)含量采用凱氏半微量定氮法(GB /T 6432—1994)測(cè)定，粗脂肪(EE)含量采用索氏乙醚提取法(GB /T 6433—2006)測(cè)定，粗灰分(Ash)含量采用 550 ℃ 灰化法(GB /T 6438—2007) 測(cè)定，粗纖維( CF) 含 量 參 照 GB /T 6434—2006/ISO 68652000 的方法測(cè)定;鉻含量參照 GB /T 13088—2006的方法，經(jīng)濕法消解(硝酸加高氯酸)處理后，使用原子吸收光譜儀(日立 －Z－5000，日立集團(tuán)，日本)測(cè)定。

1.4.3  養(yǎng)分表觀消化率的測(cè)定

在正試期第 30 ～ 35 天的飼糧中添加 0.3%的三氧化二鉻(Cr 2O 3)作為外源指示劑，測(cè)定養(yǎng)分表觀消化率。3 d 預(yù)試期后，于試驗(yàn)期第 33～35 天，每天從每個(gè)重復(fù)中選取有代表性的糞樣約 200 g，－20 ℃保存。將 3 d 的糞樣混合均勻，一部分用于VFA 含量的測(cè)定;一部分置于 65 ℃ 烘箱中 72 h，回潮 24 h 后，粉碎樣品過 40 目，按照四分法取樣500 g，－4 ℃保存待測(cè)。

養(yǎng)分表觀消化率(%)= 100－［(飼糧中鉻含量 × 糞中某養(yǎng)分含量) /(糞中鉻含量 ×飼糧中某養(yǎng)分含量)］×100。

1.4.4  血樣的采集、處理與測(cè)定

于正試期第 35 天晨飼前，每個(gè)重復(fù)選擇 3 頭豬，空腹經(jīng)前腔靜脈采血 15 mL 于真空促凝采血管中，傾 斜 靜 止 30 min 后，4 000 r/min 離 心10 min，分離血清，－20 ℃ 保存，用于血清生化、抗氧化及免疫指標(biāo)的測(cè)定。

谷 草 轉(zhuǎn) 氨 酶 ( aspartate aminotransferase，AST)、谷 丙 轉(zhuǎn) 氨 酶 ( alanine aminotransferase，ALT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP) 活性及總蛋白(total protein，TP)、膽固醇(cholesterol，CHOL)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、尿素氮(urea nitrogen，UN)含量使用 COBUS MIＲA Plus 自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

化學(xué)比色法測(cè)定谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過氧化氫酶(catalase，CAT)活性以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定免疫球蛋白 A(immunoglobulin A，IgA)和免疫球蛋白 G(immunoglobulinG，IgG)含量，所用試劑盒購于南京建成生物工程研究所，并嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.5  數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SAS 9.2 軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間差異性及趨勢(shì)性判定標(biāo)準(zhǔn)分別為 P＜0.05 和 0.05≤P＜0.10。

2  結(jié)果與分析

2.1 SFVD  對(duì)育肥豬生長性能的影響

由表 5 可見，與對(duì)照組相比，基礎(chǔ)飼糧中添加5%的 SFVD 對(duì)育肥豬 ADFI 具有一定的促進(jìn)趨勢(shì)(P=0.056)，對(duì) ADG 和 F/G 均沒有顯著影響(P＞0.05)。

2.2  SFVD 對(duì)育肥豬養(yǎng)分表觀消化率的影響

由表 6 可見，與對(duì)照組相比，基礎(chǔ)飼糧中添加5%的 SFVD 顯著降低了育肥豬飼糧中 DM、CP、OM 和 GE 表觀消化率(P＜0.05)，對(duì) EE 表觀消化率有一定的促進(jìn)趨勢(shì)(P= 0.052)，對(duì) CF 表觀消化率沒有顯著影響(P＞0.05)。

2.3  SFVD 對(duì)育肥豬血清生化指標(biāo)的影響

由表 7 可見，與對(duì)照組相比，基礎(chǔ)飼糧中添加5%的 SFVD 顯著提高了育肥豬血清 AST 活性(P＜0.05)，血清AST /ALT 和HDL 含量也呈現(xiàn)出一定的升高趨勢(shì)(P = 0.082 和 P= 0.055)，對(duì)血清ALT、ALP 活性及 TP、UN、CHOL、TG 和 LDL 含量沒有顯著影響(P＞0.05)。

2.4  SFVD 對(duì)育肥豬血清抗氧化和免疫指標(biāo)的影響

由表 8 可見，與對(duì)照組相比，基礎(chǔ)飼糧中添加5%的 SFVD 顯著提高了育肥豬血清 GSH-Px 活性(P＜0.05)，對(duì)血清 SOD、CAT 活性及 MDA 含量均沒有顯著影響(P＞0.05);血清 IgA 含量呈現(xiàn)出一定的升高趨勢(shì)(P = 0.077)，而對(duì)血清 IgG 含量沒有顯著影響(P＞0.05)。

2.5  SFVD 對(duì)育肥豬糞便中 VFA 含量的影響

3  討 論

3.1  SFVD 對(duì) 育 肥 豬 生 長 性 能 和 養(yǎng) 分 表 觀消化率的影響

飼料經(jīng)發(fā)酵處理后，可將飼料中的大分子有機(jī)物降解為更容易被機(jī)體利用的小分子物質(zhì)，同時(shí)產(chǎn)生大量菌體蛋白及多種代謝產(chǎn)物。其中，乳酸及多種 VFA 的存在使其具備酸香味，從而改善飼料適口性，邏輯上利于動(dòng)物生長性能的提高。然而，發(fā)酵飼料對(duì)動(dòng)物生長性能及養(yǎng)分消化率方面的研究結(jié)論卻并不十分一致。

眾多研究表明，發(fā)酵飼料對(duì)育肥豬、肉雞、肉兔、朗德鵝、羔羊及肉牛的生長性能及表觀消化率均表現(xiàn)出良好的促進(jìn)作用。周映華等采用復(fù)合菌種(乳酸菌∶釀酒酵母∶枯草芽孢桿菌 =1∶1∶1)對(duì)育肥豬全價(jià)飼料進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果顯示，發(fā)酵飼料與基礎(chǔ)飼糧 1∶4 混合使用，能夠顯著提高育肥豬的 ADG 和 ADFI，降低F/G，同時(shí)顯著提高飼糧中 CP 和 CF 的表觀消化率，這與 Hu 等的研究結(jié)果吻合。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)飼糧中添加 5%的 SFVD 使飼糧適口性得到改善，進(jìn)而提高了育肥豬的 ADFI，這與前期眾多報(bào) 道 一 致。此 外，基 礎(chǔ) 飼 糧 中 添 加 5% 的SFVD 對(duì)育肥豬的 ADG 和 F/G 均沒有造成顯著影響，可能與飼糧中 DM、CP、OM 和 GE 的表觀消化率降低有關(guān)。研究表明，飼糧中 CF 水平每提高1%，反芻動(dòng)物 OM 的消化率降低 0.65% ～0.70%，單胃動(dòng)物降低 1.35% ～1.40%，且不同纖維源對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響不同。本試驗(yàn)以醋糟和小麥麩為纖維源制作的 SFVD(CF 含量 16.4%)，基礎(chǔ)飼糧中添加 5%的 SFVD 使育肥豬飼糧 CF 表觀消化率提高了 0. 61%，OM 表觀消化率降低了1.69%，這可能與所選纖維源不可溶非淀粉多糖(insoluble non-starch polysaccharide，INSP)含量較高有關(guān)。飼糧中可溶性非淀粉多糖(soluble non-starch polysaccharide，SNSP)含量過高可造成食糜的營養(yǎng)屏障效應(yīng)，而 INSP 含量過高使食糜流通速度加快，是導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)消化率降低的重要原因。因此，不同制備工藝的生物飼料對(duì)育肥豬生長性能及養(yǎng)分表觀消化率的影響不同，而有關(guān)纖維組分與養(yǎng)分表觀消化率間的相關(guān)性及其作用機(jī)理的研究，尚需進(jìn)一步證實(shí)。

3.2  SFVD 對(duì)育肥豬血清生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)是反映機(jī)體代謝及各組織器官功能的間接體現(xiàn)。正常生理狀態(tài)下，ALT 和 AST分別主要存在于胞質(zhì)和線粒體中，尤以肝臟和心肌細(xì)胞中活性最高。當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，胞膜通透性改變，大量的 ALT 和 AST 涌入血液，致使血液中ALT 和 AST 活性升高。因此，ALT 和 AST 常被用作肝臟及心肌疾患檢測(cè)的敏感指標(biāo)。本試驗(yàn)條件下，基礎(chǔ)飼糧中添加 5%的 SFVD 顯著提高了育肥豬血清 AST 活性，提示可能對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生了負(fù)面影響，但由于 2 組血清 AST 活性均處于較低水平，臨床學(xué)意義不大，故在此不做冗余討論。此外，在血清 AST 和 ALT 活性均未出現(xiàn)顯著異常的前提下，AST /ALT 的上升并不足以斷定本研究過程中出現(xiàn)了肝損傷。

研究表明，飼喂發(fā)酵飼料能夠提高豬血清 TP和 UN 含量，促進(jìn)機(jī)體蛋白質(zhì)的整體代謝，同時(shí)對(duì)血清 ALP 活性具有顯著的促進(jìn)作用，提示發(fā)酵飼料的使用對(duì)豬的生長發(fā)育具有潛在的促進(jìn)作用。而本研究發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)飼糧中添加 5%的 SFVD并未對(duì)育肥豬血清 TP、UN 含量及 ALP 活性造成顯著影響，這可能與發(fā)酵飼料的原料、工藝及使用量密切相關(guān)。值得一提的是，試驗(yàn)組血清中 HDL含量呈現(xiàn)出高于對(duì)照組的趨勢(shì)，提示 SFVD 對(duì)育肥豬血脂代謝可能具有潛在促進(jìn)作用，推測(cè)原因可能與 VFA 的大量產(chǎn)生有關(guān)，本研究結(jié)果與前人報(bào)道基本一致。此外，本試驗(yàn)條件下，2 組間血清 ALP 活性及 TP、UN、CHOL、TG 和 LDL 含量均未表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.3  SFVD 對(duì)育肥豬血清抗氧化和免疫指標(biāo)的影響

發(fā)酵飼料中含有豐富的微生物，可作為獨(dú)立抗原，在刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)和提高氧化應(yīng)激能力等方面具有重要的作用。徐秀景等試驗(yàn)表明，采用乳酸菌發(fā)酵飼料飼喂生長育肥豬，能夠提高血清中 GHS-Px 等抗氧化物酶活性，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力。本試驗(yàn)條件下，基礎(chǔ)飼糧中添加 5%的SFVD 顯著提高了育肥豬血清 GSH-Px 活性，而對(duì)血清 SOD、CAT 活性及 MDA 含量均未造成顯著影響。本試驗(yàn)采用的 SFVD 含有豐富的植物乳桿菌(2.7×10 7 CFU /g)等益生菌，可通過與金屬離子螯合，降低羥自由基前體的含量，也能產(chǎn)生 GSH-Px、阿魏酸酯酶(FAE)以及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化酶，阻止高活性氧的形成，從而提高機(jī)體抗氧化能力。

此外，有研究表明，采用無抗生素發(fā)酵飼料飼喂斷奶仔豬，可以通過增加小腸上皮間淋巴細(xì)胞、M 細(xì)胞和 CD3 + T 細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而提高小腸的黏膜免疫 。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組血清 IgA 含量呈現(xiàn)出一定升高趨勢(shì)，提示 SFVD 也可能對(duì)育肥豬的黏膜免疫具有潛在的促進(jìn)作用，這與 Ahmed 等的研究結(jié)果一致。盡管研究者對(duì)發(fā)酵飼料提高機(jī)體免疫功能的觀點(diǎn)普遍認(rèn)可，但其微生物與機(jī)體免疫間可能存在的對(duì)話機(jī)制仍有待畜牧工作者進(jìn)一步探索。

3.4  SFVD 對(duì)育肥豬糞便中 VFA 含量的影響

腸道中微生物發(fā)酵產(chǎn)生的 VFA 主要以乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)為主。報(bào)道顯示，VFA 與腸上皮細(xì)胞的代謝、增殖分化、肝臟的脂質(zhì)代謝等密切相關(guān)。值得強(qiáng)調(diào)的是，腸道中 VFA 總量的 95%可被吸收代謝，最高可提供宿主所需能量的9% 。本 研 究 顯 示，基 礎(chǔ) 飼 糧 中 添 加 5% 的SFVD 顯著提高了育肥豬糞便中丙酸含量，糞便中甲酸和 TVFA 含量也呈現(xiàn)出一定的升高趨勢(shì)，而對(duì)糞便中乳酸、乙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸含量沒有顯著影響。推測(cè)可能與飼糧結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)，一方面，試驗(yàn)組相對(duì)較高的纖維水平，為動(dòng)物后腸道產(chǎn) VFA 菌群提供了良好的培養(yǎng)基質(zhì);另一方面也可能與 SFVD 自身含有的高活菌數(shù)及VFA 有關(guān)，提示本工藝條件下的 SFVD 對(duì)腸道健康具有潛在的促進(jìn)作用。

眾多學(xué)者認(rèn)為，VFA 可通過降低腸道 pH 來抵御感染及致病菌的侵襲。研究表明，飼喂發(fā)酵飼料可降低不同腸段腸桿菌科和沙門氏菌數(shù)量，提高乳酸桿菌數(shù)量，推測(cè)原因?yàn)榘l(fā)酵飼料使腸道中乳酸及 VFA 含量增加，導(dǎo)致 pH下降所致。菌體細(xì)胞內(nèi)酸解離導(dǎo)致 pH 下降，從而致使酶和質(zhì)子動(dòng)力泵坍塌，輔以陰離子自身的殺傷效應(yīng)，達(dá)到破壞菌體的效果。誠然，pH對(duì)腸道微生物區(qū)系的穩(wěn)定至關(guān)重要，而另有學(xué)者認(rèn)為，解離的乳酸和 VFA 不能自由穿越菌體膜，因而腸桿菌科和沙門氏菌數(shù)量的減少只與未解離的部分有關(guān)。盡管 VFA 對(duì)腸道健康的正面效應(yīng)已被眾多研究者普遍認(rèn)可，但飼糧 － 菌群 －VFA軸的相關(guān)性尚不十分明確。有關(guān)飼糧對(duì)宿主腸道微生物的調(diào)控機(jī)制研究，將是本課題組接下來的重要探究內(nèi)容之一。

4  結(jié) 論

基礎(chǔ)飼糧中添加 5%的本工藝條件下制備的SFVD 對(duì)育肥豬生長性能、腸道健康及免疫性能的提高具有潛在的促進(jìn)作用。

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