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隨著全球經(jīng)濟的蓬勃發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，人類對于畜產(chǎn)品的需求量逐年增大，從而促使畜牧業(yè)在規(guī)模與質(zhì)量上不斷發(fā)展。在全球人口日益增多的背景下，如何利用生物技術(shù)方法開發(fā)新型飼料資源并提高動物對原有飼料原料利用率成為解決不斷增長的畜產(chǎn)品需求量和日益緊縮的耕地面積之間矛盾的有效途徑之一。

研究表明，飼料經(jīng)益生菌發(fā)酵后，菌種產(chǎn)生的多種代謝產(chǎn)物不僅能夠提高飼料原料中蛋白質(zhì)、脂肪和糖類等成分的營養(yǎng)轉(zhuǎn)化率，同時能夠降解常用飼料原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子等有害成分，擴大飼料原料的使用范圍，提高原有飼料的營養(yǎng)價值。另外，發(fā)酵飼料能夠改善飼料適口性，調(diào)節(jié)動物腸道的微生態(tài)平衡，提高了畜禽產(chǎn)品的食品安全性。目前，應(yīng)用于微生物發(fā)酵飼料的菌種類型主要有酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌、曲霉等。其中，酵母菌是單細胞真核微生物的一種，能夠發(fā)酵糖類物質(zhì)，其本身含有豐富的氨基酸、維生素、酶類等物質(zhì)，是直接食用最多的一種微生物，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中已有廣泛的應(yīng)用。本研究分別采用釀酒酵母、熱帶假絲酵母和馬克思克魯維酵母對５種常用飼料原料小麥、玉米、豌豆、大豆和豆粕進行發(fā)酵處理，對發(fā)酵前后的營養(yǎng)指標和抗?fàn)I養(yǎng)因子含量進行比較測定，為發(fā)酵原料在飼料工業(yè)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

１ 材料與方法

１.１ 試驗材料

１.１.１ 菌種　

熱帶假絲酵母（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）和釀酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。馬克思克魯維酵母（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｘｉａｎｕｓ）由淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院張瞳老師饋贈。

１.１.２ 原料及處理　

 發(fā)酵原料為市售小麥、玉米、豌豆、大豆和豆粕。將原料除雜后進行粉碎，過４０目篩，作為酵母菌發(fā)酵基礎(chǔ)料。

１.１.３  培養(yǎng)基配制　

１號試劑：酵母膏１０ｇ，蛋白胨２０ｇ，瓊脂粉２０ｇ（液體培養(yǎng)基不加），蒸餾水９００ｍＬ；２號試劑：葡萄糖２０ｇ，蒸餾水１００ｍＬ。將１號試劑瓶和２號試劑瓶分別配制滅菌，待溫度冷卻至６０～７０℃后混合均勻。

１.１.４ 試驗地點及時間　

試驗地點為淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，試驗時間為２０１８年３—５月。

１.２ 試驗方法

１.２.１ 菌的活化及擴大培養(yǎng)　

將酵母菌凍干粉瓶打碎后，用液體培養(yǎng)基溶解，吸取１００μＬ接種至固體培養(yǎng)基表面，均勻涂布，３０℃培養(yǎng)２４～４８ｈ后，選擇菌落生長良好的培養(yǎng)皿，相同條件下進行劃線培養(yǎng)，挑取單菌落，裝入液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，菌懸液混合均勻后按照１∶５０接種量擴大培養(yǎng)，測定菌液Ｄ值，制備接種菌液。

１.２.２發(fā)酵　

每種原料稱?。玻埃埃?，１１０℃加熱７ｍｉｎ，各種酵母的接種量均為１.０×107ｃｆｕ／ｇ，原料與水分比例為１∶１?；旌暇鶆蚝?，裝入發(fā)酵袋中排空空氣靜置發(fā)酵，發(fā)酵溫度為３０℃，發(fā)酵時間為２４、４８、７２、９６ｈ。每隔１２ｈ檢查１次將袋中氣體排空，發(fā)酵完畢后樣品置于－２０℃冰箱里待測。

１.３ 指標測定

１.３.１ ｐＨ值的測定　

取每株菌發(fā)酵的各時間段的每種發(fā)酵原料樣品５ｇ于小燒杯中，加入４５ｍＬ蒸餾水，每隔５ｍｉｎ攪拌１次，共攪拌３次，靜置１０ｍｉｎ后，ｐＨ計測量。

１.３.２  干物質(zhì)回收率的測定

干物質(zhì)測定方法參照ＧＢ／Ｔ８３０３—２０１３《茶　磨碎試樣的制備及其干物質(zhì)含量測定》，計算公式：干物質(zhì)回收率＝（發(fā)酵原料干物質(zhì)質(zhì)量／發(fā)酵原料質(zhì)量）／（原料干物質(zhì)質(zhì)量／原料質(zhì)量）×１００％。

１.３.３ 還原糖含量的測定　

參照王俊剛等的３，５－二硝基水楊酸法測定。準確稱?。?０ｇ樣品于１００ｍＬ三角瓶中，加入約５０ｍＬ蒸餾水，于５０℃恒溫水浴中保溫２０ｍｉｎ，期間不時攪拌使還原糖浸出。靜止三角瓶使樣品沉淀，吸取上清液８ｍＬ于離心管中，３０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，此即為還原糖測定樣品。還原糖含量以ｍｇ／ｇ計算。

１.３.４ 粗蛋白含量的測定　

依據(jù)ＧＢ／Ｔ６４３２—１９９４《飼料中粗蛋白測定方法》凱式定氮法進行測定。稱?。?３ｇ左右測定干物質(zhì)時烘干至恒重的樣品，加入催化劑和硫酸，進行消化，直至溶液透明呈藍綠色，待其冷卻，應(yīng)用自動凱氏定氮儀測定其含氮量。

１.３.５ 植酸含量測定方法　

采用分光光度法測定植酸含量。步驟大致如下：（１）稱取０.５ｇ樣品，加入６ｍＬ１.８ｍｏｌ／ＬＨＣｌ，３５℃水?。玻?，期間不斷振蕩，水浴后靜置過夜；（２）樣品４０００ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉｎ，取上清液，加入０.４ｍＬ鐵試劑，沸水?。矗担恚椋詈笤俅坞x心，棄上清液；（３）用３ｍＬ１.５ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ對沉淀進行溶解，再次離心，棄上清液；（４）加入１ｍＬ３.２ｍｏｌ／Ｌ硝酸溶解沉淀后，依次加入０.２ｍＬ９％的檸檬酸三鈉、０.２ｍＬ１％對苯二酚、０.４ｍＬ０.４％鄰菲羅啉，純水定容至５０ｍＬ，ｐＨ值調(diào)節(jié)至３～４；（５）３５℃水?。玻韬笞匀焕鋮s，于５１０ｎｍ波長處測定吸光度。計算公式：植酸含量＝Ｄ５１０ｎｍ×８.４２÷樣品質(zhì)量（ｍｇ）×１.２５×１００％。

１.３.６ 抗性淀粉含量的測定

參照高鑫（２０１２）的方法。步驟大致如下：（１）準確稱?。?２ｇ樣品于帶塞玻璃試管中，加入蒸餾水０.４ｍＬ，沸水浴２０ｍｉｎ后冷卻至室溫；（２）加入ＨＣｌ－ＫＣｌ緩沖溶液（ｐＨ值為２.０）２.５ｍＬ和１０％胃蛋白酶１０５μＬ，３７℃恒溫振蕩１ｈ；（３）加入４ｍＬ的醋酸鈉緩沖液（ｐＨ值＝６.９）和淀粉酶－糖化酶混合溶液４ｍＬ，３７℃振蕩１６ｈ；（４）４０００ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉｎ，去掉上清液，５０％乙醇溶液洗滌沉淀，重復(fù)２次；（５）依次加入２ｍＬ２ｍｏｌ／ＬＫＯＨ溶液，８ｍＬ醋酸鈉緩沖液（ｐＨ值為３.８），１００μＬ糖化酶溶液，６０℃水?。保瑁唬ǎ叮├鋮s至室溫，４０００ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉｎ，保留上清液；（７）根據(jù)“１.３.３”節(jié)還原糖測定方法測定上清液中的還原糖含量。計算公式：抗性淀粉含量＝還原糖含量×０.９。

１.４ 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計學(xué)分析采用ＳＰＳＳ１７.０（ＳＰＳＳＩｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）軟件的Ｏｎｅ－ＷａｙＡＮＯＶＡ進行統(tǒng)計分析，計算結(jié)果以“平均值±標準誤”表示。Ｐ＜０.０５表示差異顯著。

２　結(jié)果與分析

２.１ 不同飼料原料經(jīng)３種酵母菌發(fā)酵后ｐＨ值的變化規(guī)律

由圖１可知，小麥和玉米分別經(jīng)３種酵母發(fā)酵２４ｈ后ｐＨ值均顯著降低（Ｐ＜０.０５），且于４８～９６ｈ內(nèi)趨于穩(wěn)定水平，呈明顯的酸性。豌豆和豆粕分別經(jīng)釀酒酵母和熱帶假絲酵母發(fā)酵２４ｈ后ｐＨ值均顯著降低（Ｐ＜０.０５），但隨后于７２ｈ后逐漸恢復(fù)至初始ｐＨ值。大豆原料經(jīng)３種酵母發(fā)酵７２ｈ后ｐＨ值均顯著升高（Ｐ＜０.０５），呈明顯堿性。

２.２ 不同飼料原料經(jīng)３種酵母菌發(fā)酵后干物質(zhì)回收率的變化規(guī)律

由圖２可知，小麥原料經(jīng)３種酵母發(fā)酵７２ｈ后干物質(zhì)回收率顯著降低（Ｐ＜０.０５），玉米原料經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵后干物質(zhì)回收率呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，而經(jīng)熱帶假絲酵母和馬克斯克魯維酵母發(fā)酵７２ｈ和９６ｈ后干物質(zhì)回收率則顯著降低（Ｐ＜０.０５）。豌豆經(jīng)釀酒酵母和熱帶假絲酵母發(fā)酵９６ｈ后干物質(zhì)回收率顯著降低，但不受馬克斯克魯維酵母發(fā)酵影響（Ｐ＞０.０５）。大豆分別經(jīng)熱帶假絲酵母和馬克斯克魯維酵母發(fā)酵７２ｈ和４８ｈ后干物質(zhì)回收率顯著降低（Ｐ＜０.０５），豆粕原料分別經(jīng)釀酒酵母和馬克斯克魯維酵母發(fā)酵７２ｈ后干物質(zhì)回收率顯著降低（Ｐ＜０.０５），而經(jīng)熱帶假絲酵母發(fā)酵７２ｈ后干物質(zhì)回收率卻顯著上升（Ｐ＜０.０５）。

２.３ 不同飼料原料經(jīng)３種酵母菌發(fā)酵后還原糖含量的變化規(guī)律

由圖３可知，玉米原料分別經(jīng)釀酒酵母和馬克斯克魯維酵母發(fā)酵２４ｈ后還原糖含量顯著下降（Ｐ＜０.０５），而大豆、豌豆和豆粕原料經(jīng)２種酵母發(fā)酵后還原糖含量均表現(xiàn)出先升高后降低的規(guī)律。豌豆原料經(jīng)熱帶假絲酵母發(fā)酵２４ｈ后還原糖含量顯著降低（Ｐ＜０.０５），而其他原料均表現(xiàn)出先升高后降低的規(guī)律。

２.４ 不同飼料原料經(jīng)３種酵母菌發(fā)酵后粗蛋白含量的變化規(guī)律

由圖４可知，釀酒酵母發(fā)酵豆粕原料９６ｈ時粗蛋白含量顯著降低（Ｐ＜０.０５），而發(fā)酵其他４種飼料原料對蛋白含量無顯著影響（Ｐ＞０.０５）。熱帶假絲酵母發(fā)酵小麥、玉米、大豆和豆粕４種原料７２～９６ｈ內(nèi)粗蛋白含量均出現(xiàn)顯著升高現(xiàn)象（Ｐ＜０.０５）。馬克斯克魯維酵母發(fā)酵玉米２４ｈ時，粗蛋白含量顯著升高（Ｐ＜０.０５），但隨后降低至初始水平，而發(fā)酵豆粕原料７２ｈ后粗蛋白含量顯著升高（Ｐ＜０.０５）。

２.５ 不同飼料原料經(jīng)３種酵母菌發(fā)酵后植酸含量的變化規(guī)律

由圖５可知，釀酒酵母發(fā)酵２４ｈ后，大豆、豆粕、小麥植酸含量顯著降低（Ｐ＜０.０５）；豌豆發(fā)酵７２ｈ后，植酸含量的去除率達到４９．３％（Ｐ＜０.０５）；玉米的植酸含量在發(fā)酵４８ｈ內(nèi)無顯著變化（Ｐ＞０.０５）。熱帶假絲酵母發(fā)酵２４ｈ時，大豆、豌豆、小麥植酸含量顯著降低（Ｐ＜０.０５）；發(fā)酵４８ｈ之后豆粕植酸含量的去除率達到５５．３％（Ｐ＜０.０５），玉米的植酸含量無顯著變化（Ｐ＞０.０５）。馬克思克魯維酵母發(fā)酵２４ｈ后，大豆、豆粕、小麥植酸含量顯著降低（Ｐ＜０.０５），玉米與豌豆發(fā)酵４８ｈ后植酸含量顯著降低（Ｐ＜０.０５）。馬克思克魯維酵母對大豆植酸含量降低效果最為顯著，對其植酸去除率達到６８.１％。

２.６ 不同飼料原料經(jīng)３種酵母菌發(fā)酵后抗性淀粉含量的變化規(guī)律

由圖６可知，釀酒酵母發(fā)酵４８ｈ后，小麥原料的抗性淀粉含量顯著降低（Ｐ＜０.０５），而豌豆和玉米則在發(fā)酵７２ｈ抗性淀粉含量顯著降低（Ｐ＜０.０５）。豌豆和小麥經(jīng)熱帶假絲酵母發(fā)酵２４ｈ后抗性淀粉含量顯著降低（Ｐ＜0.０５）。馬克思克魯維酵母發(fā)酵４８ｈ后豌豆抗性淀粉含量降低４４％（Ｐ＜０.０５）；發(fā)酵７２ｈ后，小麥與玉米抗性淀粉含量分別降低了４３％和５２％（Ｐ＜０.０５）；大豆和豆粕則在發(fā)酵過程中抗性淀粉含量無顯著變化（Ｐ＞０.０５）。

３ 討論

ｐＨ值是生物發(fā)酵工藝中的一個非常重要的參數(shù)，飼料原料發(fā)酵過程中ｐＨ值降低主要歸結(jié)于發(fā)酵菌種增殖過程中產(chǎn)生并積累的有機酸，微生物發(fā)酵飼料中酸含量的增加反過來有利于飼料的長期保存。本試驗中，小麥和玉米原料經(jīng)釀酒酵母、熱帶假絲酵母和馬克斯克魯維酵母發(fā)酵后ｐＨ值均呈現(xiàn)顯著下降趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌本身產(chǎn)酸能力并不強，在發(fā)酵過程中可將葡萄糖代謝產(chǎn)物———丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸、乙酸或乙醇，這可能是誘發(fā)原料ｐＨ值在發(fā)酵初期降低的因素之一。隨著發(fā)酵后期乙醇的積累，酵母細胞的生長受到抑制，丙酮酸代謝產(chǎn)酸途徑被切斷，因此ｐＨ值無法持續(xù)降低。也有研究人員認為，原料本身未被滅菌的乳酸菌在發(fā)酵過程中得到一定程度的增殖，且酵母菌增殖過程中產(chǎn)生的丙酮酸、琥珀酸等代謝產(chǎn)物能夠刺激乳酸菌的活動，為其提供營養(yǎng)物質(zhì)，因而誘導(dǎo)原料ｐＨ值的迅速降低。本試驗還發(fā)現(xiàn)大豆在酵母菌發(fā)酵后期ｐＨ值逐漸升高，說明蛋白類原料和淀粉類原料被酵母菌發(fā)酵的效果存在較大差異。作者推測這種差異可能歸結(jié)于酵母菌在不同發(fā)酵底物下積累的代謝產(chǎn)物不同所導(dǎo)致，在本試驗發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)，大豆發(fā)酵后期出現(xiàn)腥味，可能是揮發(fā)性氨類和硫化物。劉倚帆等報道，酵母菌和米曲霉協(xié)同發(fā)酵整粒菜籽后期ｐＨ值也出現(xiàn)一定程度的升高。因此，全脂大豆或菜籽中較高含量的蛋白質(zhì)以及脂肪可能是酵母菌發(fā)酵后期ｐＨ升高的主要因素。本研究中豆粕和豌豆在３種不同酵母菌發(fā)酵下ｐＨ值呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律也說明不同酵母菌在單一發(fā)酵底物下的代謝方式和途徑存在一定差異。

Ｔｅｒｅｂｉｚｎｉｋ等認為益生菌固態(tài)發(fā)酵過程中干物質(zhì)損失量和生物量呈正相關(guān)。這一點在馬克斯克魯維酵母發(fā)酵中尤為明顯，酵母菌分解利用發(fā)酵底物中的物質(zhì)合成自身成分，并釋放出代謝產(chǎn)物，在這一過程中，干物質(zhì)量在發(fā)酵后期呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。但本試驗也發(fā)現(xiàn)，熱帶假絲酵母發(fā)酵豆粕后期干物質(zhì)回收率出現(xiàn)升高趨勢，說明發(fā)酵物料中的生物量增長速度超過了發(fā)酵底料的消耗速度，筆者推測這種現(xiàn)象可能只是短暫出現(xiàn)，隨著發(fā)酵的繼續(xù)進行，發(fā)酵底物的消耗速度勢必會超過生物量的增長。

酵母菌最重要的營養(yǎng)物質(zhì)和能量來源大部分來自于單糖，而發(fā)酵纖維素等多糖的能力有限，這一點與枯草芽孢桿菌不同。大量研究報道，在果酒、泡菜等釀造發(fā)酵過程中，酵母菌能夠迅速降解底物中已有的還原糖成分，將其轉(zhuǎn)化為酸類、酯類或醇類物質(zhì)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，玉米分別經(jīng)釀酒酵母和馬克斯克魯維酵母發(fā)酵后還原糖含量持續(xù)下降，而大豆、豌豆和豆粕原料經(jīng)２種酵母發(fā)酵后還原糖含量均表現(xiàn)出先升高后降低的規(guī)律。豌豆經(jīng)熱帶假絲酵母發(fā)酵后還原糖含量持續(xù)降低，而其他原料均表現(xiàn)出先升高后降低的規(guī)律。由此說明，不同酵母菌作用于不同飼料原料底物，產(chǎn)生能夠分解多糖的酶的性質(zhì)不同，后期當(dāng)?shù)矸鄣榷嗵墙?jīng)酵母菌酶解成為還原糖后反過來又促進了酵母菌的增殖。

本研究結(jié)果表明，熱帶假絲酵母發(fā)酵小麥、玉米、大豆和豆粕４種原料可提高原料的粗蛋白水平，這一點優(yōu)于釀酒酵母和馬克斯克魯維酵母。研究報道，生產(chǎn)上利用淀粉、葡萄糖、玉米深加工副產(chǎn)物等作為熱帶假絲酵母、釀酒酵母大量培養(yǎng)的底物，酵母本身蛋白質(zhì)含量為４５％～６０％，其大量增殖的同時提高了發(fā)酵底物的粗蛋白含量，從而使底物的可飼性大大提高，可最大限度上替代魚粉等其他動物源蛋白質(zhì)飼料。本研究中單一飼料原料的成分及含量均有所不同，可能是造成不同酵母增殖效果差異的重要因素。

植酸在植物種子的胚芽和谷物的麩皮中含量較高，尤其是在豆科植物的種子中含量最高。植酸可與常見的礦物元素產(chǎn)生不溶性化合物，大大降低其有效性，因而成為重要的抗?fàn)I養(yǎng)因子之一。本試驗測定結(jié)果顯示，大豆和豌豆中植酸含量較高，但豆粕中植酸含量甚至低于玉米和小麥。這可能與大豆在壓榨獲得油脂過程中經(jīng)歷高溫高壓等物理因素有關(guān)。研究報道，酵母菌能夠有效降解植物籽實中的植酸，因而有利于單胃動物對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，這可能與酵母菌能夠產(chǎn)植酸酶有直接關(guān)系。本試驗中馬克思克魯維酵母在發(fā)酵４８ｈ后各原料的植酸含量下降均較為明顯，顯示出較好的去除效果，因而在實際生產(chǎn)上具有一定的借鑒意義。

抗性淀粉是一種細胞壁成分，部分與水相溶形成粘性物質(zhì)，阻礙了動物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。本試驗中酵母菌對玉米、小麥和豌豆等抗性淀粉含量較高的原料降解效果較好，而對大豆和豆粕的抗性淀粉降解效果較差。目前利用微生物發(fā)酵法降解植物籽實中的抗性淀粉尚未見報道。筆者認為不同原料中抗性淀粉的類型存在差異，酵母菌在不同底物上的發(fā)酵效果也有所不同，分解抗性淀粉可能主要靠分泌的纖維素酶或淀粉酶發(fā)揮作用，但由于酵母菌對復(fù)雜多糖的利用效果有限，因此僅依靠酵母菌發(fā)酵難以達到有效降解飼料中抗性淀粉的目的。

綜上所述，不同種類酵母菌對能量型和蛋白型飼料原料的發(fā)酵效果存在差異?？傮w上，經(jīng)過３種酵母菌發(fā)酵后的能量型飼料（小麥和玉米）酸度顯著增加，而蛋白型飼料（豌豆、大豆和豆粕）經(jīng)釀酒酵母和熱帶假絲酵母發(fā)酵后期ｐＨ值升高。通過控制菌種和時間可在發(fā)酵早期增加原料中還原糖和粗蛋白的含量，但隨著發(fā)酵的進行，還原糖逐漸被消耗。此外，３種酵母菌能夠有效降解飼料原料中的植酸，但僅對能量型飼料的抗性淀粉有一定的降解效果。

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