１.１ 試驗(yàn)材料

飼料桑粉由湖南省蠶?？茖W(xué)研究所提供，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)成分含量為：粗蛋白質(zhì) ２２.９６％、粗脂肪 ６.２６％、粗纖維 ９.１８％、粗灰分 １３.９０％、鈣４.３７％和磷 ０.４６％。添加飼料桑粉的發(fā)酵試驗(yàn)組采用全發(fā)酵方式（將不同比例的飼料桑粉添加至飼糧中后，對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵處理），將乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌按 ２∶１∶１ 的比例制成混合菌種，活菌數(shù)≥３×１０９ＣＦＵ／ｇ，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵處理。發(fā)酵設(shè)備及試驗(yàn)飼糧由湖南楚溈香農(nóng)業(yè)有限公司提供。

１.２ 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選?。梗邦^平均體重為３０ｋｇ 左右的寧鄉(xiāng)花豬，隨機(jī)分為５個(gè)組，每組３個(gè)重復(fù)（欄），每個(gè)重復(fù) ６ 頭豬。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組分別飼喂添加９％、１２％、１５％飼料桑粉的全發(fā)酵料和 ９％飼料桑粉的未發(fā)酵料。試驗(yàn)于２０１６ 年７～９月在湖南寧鄉(xiāng)大龍畜牧科技有限公司豬場(chǎng)進(jìn)行，試驗(yàn)分為２個(gè)階段，中豬階段（試驗(yàn)期第１～５０ 天）和大豬階段（試驗(yàn)期第５１～７５天）。飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表１ 和表２。

１.３ 飼養(yǎng)管理與采樣

根據(jù)豬場(chǎng)常規(guī)程序進(jìn)行飼養(yǎng)管理。預(yù)試期３ ｄ，自由采食、飲水。試驗(yàn)期的第５０天，空腹１２ｈ后，各重復(fù)（欄）隨機(jī)選取 １ 頭試驗(yàn)豬進(jìn)行前腔靜脈采集血液（１０ ｍＬ×２），３０００ ｒ／ ｍｉｎ 離心 １０ ｍｉｎ后收集血清，－２０ ℃凍存待測(cè)；試驗(yàn)期第７５天時(shí)，各重復(fù)（欄）隨機(jī)選取１頭試驗(yàn)豬進(jìn)行屠宰，采集血液制備血清待測(cè)。試驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行屠宰試驗(yàn)，稱取０.１ｇ 左右肝臟組織樣品，加入９ 倍體積的生理鹽水后使用勻漿機(jī)制成 １０％的組織勻漿液，再將其在４ ℃下３０００ ｒ／ ｍｉｎ 離心１０ ｍｉｎ，取上清液待用；分離腸道，收集回腸食糜，封裝在 ５ ｍＬ 塑料離心管內(nèi)，－８０ ℃ 凍存，用于回腸微生物測(cè)定；將十二指腸、空腸、回腸內(nèi)容物清除干凈后，再用生理鹽水沖洗腸道，分別剪取各腸段２ｃｍ 置于甲醛固定液中，用于腸道組織形態(tài)測(cè)定。

１.４ 測(cè)定指標(biāo)及方法

１.４.１ 血清抗氧化指標(biāo)

測(cè)定 ２ 個(gè)階段（第 ５０ 天和第 ７５ 天）血清中丙二醛（ＭＤＡ）含量、總超氧化物歧化酶（Ｔ⁃ＳＯＤ）和谷胱甘肽過氧化物酶（ＧＳＨ⁃Ｐｘ）活性以及總抗氧化能力（Ｔ⁃ＡＯＣ）。測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，并按照試劑盒說明書進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

１.４.２ 肝臟抗氧化指標(biāo)

測(cè)定肝臟中 ＭＤＡ 含量、Ｔ⁃ＳＯＤ 和 ＧＳＨ⁃Ｐｘ 活性以及 Ｔ⁃ＡＯＣ。測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，并按照試劑盒說明書進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

１.４.３ 腸道組織形態(tài)

制作腸道組織切片，觀察腸道組織結(jié)構(gòu)，具體測(cè)量十二指腸、空腸、回腸的絨毛高度和隱窩深度，并計(jì)算絨毛高度與隱窩深度比（Ｖ／ Ｃ）。

１.４.４ 腸道菌群

利用糞便基因組 ＤＮＡ 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），按試劑盒說明書提取試驗(yàn)豬回腸食糜 ＤＮＡ。對(duì) ＤＮＡ 樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格的樣品構(gòu)建文庫(kù)委托華大基因完成，內(nèi)容包括：回收目的 Ａｍｐｌｉｃｏｎ 片段，用 Ｔ４ ＤＮＡ 聚合酶、Ｋｌｅ⁃ｎｏｗ ＤＮＡ 聚合酶和 Ｔ４ 多核苷酸激酶（ＰＮＫ）將打斷形成的黏性末端修復(fù)成平末端，再通過 ３′端加堿基“Ａ”，使得 ＤＮＡ 片段能與 ３′端帶有“Ｔ”堿基的特殊接頭連接；或者設(shè)計(jì)合成含有測(cè)序接頭的雙 Ｉｎｄｅｘ 融合引物，以基因組 ＤＮＡ 為模板，進(jìn)行融合引物 ＰＣＲ，磁珠篩選目的 Ａｍｐｌｉｃｏｎ 片段，最后，用合格的文庫(kù)進(jìn)行 ｃｌｕｓｔｅｒ 制備和測(cè)序。數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾，濾除低質(zhì)量的 ｒｅａｄｓ，剩余高質(zhì)量的ｃｌｅａｎ ｄａｔａ 方可用于后期分析；通過 ｒｅａｄｓ 之間的ｏｖｅｒｌａｐ關(guān)系將 ｒｅａｄｓ 拼接成 Ｔａｇｓ；在給定的相似度下將 Ｔａｇｓ 聚成操作分類單位（ＯＴＵ），然后通過ＯＴＵ 與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì) ＯＴＵ 進(jìn)行物種注釋；基于ＯＴＵ 和物種注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種復(fù)雜度分析以及組間物種差異分析。

１.５ 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用 Ｅｘｃｅｌ ２００７ 和ＳＰＳＳ ２０.０ 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有組間進(jìn)行方差分析，添加 ９％飼料桑粉全發(fā)酵料組與添加９％飼料桑粉未發(fā)酵料組進(jìn)行 ｔ 檢驗(yàn)，以 Ｐ＜０.０５ 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

３.１ 發(fā)酵飼料桑粉對(duì)寧鄉(xiāng)花豬機(jī)體抗氧化性能的影響

由于寧鄉(xiāng)花豬特有的生理特點(diǎn)，其體脂含量相對(duì)較高，性質(zhì)活潑的自由基可誘發(fā)體內(nèi)不飽和脂肪酸的氧化，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而降低寧鄉(xiāng)花豬肉品質(zhì)。血清及肝臟中 ＭＤＡ 含量、Ｔ⁃ＳＯＤ和 ＧＳＨ⁃Ｐｘ 活性以及 Ｔ⁃ＡＯＣ 反映了動(dòng)物機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的水平 。ＭＤＡ 是動(dòng)物機(jī)體由于自由基的氧化作用產(chǎn)生過氧化脂質(zhì)后分解代謝的產(chǎn)物，其含量越高說明動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生的過氧化脂質(zhì)越多，機(jī)體氧化損傷越嚴(yán)重；Ｔ⁃ＳＯＤ 是被稱為動(dòng)物機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的第 １ 道防線，可催化機(jī)體內(nèi)超氧陰離子自由基（Ｏ２－•）生成過氧化氫（Ｈ２Ｏ２），Ｈ２Ｏ２進(jìn) 而 與 過 氧 化 氫 酶 （ ＣＡＴ） 反 應(yīng) 生 成 水（Ｈ２Ｏ）和氧氣（Ｏ２ ），是機(jī)體清除自由基的首要物質(zhì)；ＧＳＨ⁃Ｐｘ 是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)一種具有催化過氧化物分解的酶，可以特異性的催化還原谷胱甘肽，從而使得谷胱甘肽與動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的氫過氧化物發(fā)生還原反應(yīng)，降低機(jī)體氧化損傷；Ｔ⁃ＡＯＣ 是動(dòng)物機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能狀態(tài)的一個(gè)綜合性指標(biāo)，反映了動(dòng)物機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的總體水平。章丹丹等研究發(fā)現(xiàn)，在桑枝中提取的黃酮化合物在細(xì)胞試驗(yàn)和體外化學(xué)試驗(yàn)匯總均具有抗氧化活性，有很強(qiáng)的自由基清除能力。周林從桑枝中分離提純出黃酮類化合物，通過體外模擬試驗(yàn)同樣證明桑枝中黃酮類化合物具有抗氧化活性。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)利用飼料桑粉飼喂寧鄉(xiāng)花豬可有效提高其血清中Ｔ⁃ＡＯＣ，且添加 １５％ 飼料桑粉全發(fā)酵料組血清Ｔ⁃ＡＯＣ顯著高于對(duì)照組，這與黃靜等利用桑葉粉飼喂胡須雞研究結(jié)果相似，這可能與飼料桑粉中所含的黃酮類具有的抗氧化活性有關(guān)。陳玲玲等研究桑葉黃酮對(duì)糖尿病小鼠的影響中發(fā)現(xiàn)，桑葉黃酮可有效提高小鼠肝臟中超氧化物歧化酶活性，降低肝臟中 ＭＤＡ 含量。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，飼料桑粉添加組寧鄉(xiāng)花豬肝臟 ＭＤＡ 含量相比對(duì)照組有降低的趨勢(shì)，肝臟中 Ｔ⁃ＳＯＤ、ＧＳＨ⁃Ｐｘ 活性和 Ｔ⁃ＡＯＣ 相比對(duì)照組均有所提高，說明飼料桑粉可以有效提高寧鄉(xiāng)花豬機(jī)體抗氧化水平，進(jìn)而改善肉品質(zhì)。

３.２ 發(fā)酵飼料桑粉對(duì)寧鄉(xiāng)花豬腸道組織形態(tài)的影響

小腸是動(dòng)物機(jī)體消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要部位，絨毛高度、隱窩深度及 Ｖ／ Ｃ 值是反映小腸消化吸收功能的重要指標(biāo)。小腸黏膜上有大量腸絨毛，絨毛高度越高則小腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收面積越大，消化吸收功能越強(qiáng)，絨毛萎縮引起絨毛高度的降低將導(dǎo)致小腸吸收功能的下降；隱窩深度的高低反映了腸上皮細(xì)胞的生成率，腸道隱窩的細(xì)胞不斷的向絨毛處分化，替代補(bǔ)充脫落或損傷的絨毛細(xì)胞，隱窩處細(xì)胞生成率下降將使隱窩深度變淺，表明絨毛細(xì)胞成熟率上升，小腸營(yíng)養(yǎng)吸收功能增強(qiáng)。有研究表明，隱窩深度還反映了腸上皮細(xì)胞的遷移率，隱窩深度降低則表明動(dòng)物腸上皮細(xì)胞的遷移率降低，動(dòng)物腸上皮細(xì)胞的遷移率降低可以減少能量損失，從而有利于促進(jìn)動(dòng)物生產(chǎn)性能。小腸 Ｖ／ Ｃ 值可以比較直觀地反映小腸的消化吸收能力，Ｖ／ Ｃ 值越高則代表小腸消化吸收能力越強(qiáng)。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，飼料桑粉添加組寧鄉(xiāng)花豬空腸絨毛高度及 Ｖ／ Ｃ 值相比對(duì)照組有所下降，這可能與飼料桑粉中所含的單寧及植物凝集素等抗?fàn)I養(yǎng)因子損傷腸道上皮細(xì)胞有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究；添加 ９％飼料桑粉全發(fā)酵料組相比添加 ９％飼料桑粉未發(fā)酵料組寧鄉(xiāng)花豬空腸和回腸 Ｖ／ Ｃ 值顯著提高，且在本課題組前期試驗(yàn)結(jié)果表明添加 ９％飼料桑粉全發(fā)酵料對(duì)寧鄉(xiāng)花豬生長(zhǎng)性能有一定的改善作用，說明發(fā)酵工藝可通過降低或清除飼料桑粉中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，從而降低飼料桑粉對(duì)寧鄉(xiāng)花豬腸道的損傷，進(jìn)而有益于其生產(chǎn)性能。

３.３ 發(fā)酵飼料桑粉對(duì)寧鄉(xiāng)花豬腸道菌群的影響

動(dòng)物腸道菌群的穩(wěn)態(tài)與宿主的腸道健康狀況及生產(chǎn)性能密切相關(guān)，腸道菌群的變化也可直接影響 動(dòng) 物 腸 道 對(duì) 營(yíng) 養(yǎng) 物 質(zhì) 的 吸 收 代 謝。Ｌａｍｅｎｄｅｌｌａ等研究表明，豬腸道內(nèi)的微生物中的厚壁菌門和擬桿菌門與機(jī)體對(duì)碳水化合物的代謝有一定相關(guān)。 本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，門水平上，厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門這 ３ 種門類的微生物占回腸菌群的 ９５％以上；所有寧鄉(xiāng)花豬回腸菌群共產(chǎn)生 ２５７ 個(gè) ＯＴＵ，腸道菌群相對(duì)豐度越高則越有利于維持動(dòng)物腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)物生產(chǎn)性能。 呂月琴等和舒剛等利用發(fā)酵飼料分別在蛋雞和肉雞飼養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，飼喂發(fā)酵飼料組相比未發(fā)酵飼料組，動(dòng)物腸道中的乳酸菌等益生菌數(shù)量顯著提高，大腸桿菌數(shù)量有效降低。Ｃａｎｉｂｅ 等利用發(fā)酵飼料和未發(fā)酵飼料飼喂生長(zhǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵飼料可有效提高動(dòng)物腸道有益菌數(shù)量，有利于促進(jìn)動(dòng)物腸道菌群的穩(wěn)態(tài)并提高菌群豐度。 本試驗(yàn)研究表明，全發(fā)酵料組寧鄉(xiāng)花豬回腸菌群 Ａｌｐｈａ 多樣性指數(shù)相比未發(fā)酵料組，ＯＴＵ 和 Ｃｈａｏ 指數(shù)有所提高，且各全發(fā)酵料組相比未發(fā)酵料組乳桿菌種的相對(duì)豐度更高，這可能與添加飼料桑粉飼糧經(jīng)發(fā)酵處理后，飼糧 ｐＨ 降低，飼喂寧鄉(xiāng)花豬后在腸道中提供了一個(gè)適合乳酸菌等喜酸益生菌種的大量繁殖的環(huán)境有關(guān)，此結(jié)果與鄺哲師等利用發(fā)酵桑葉粉飼喂胡須雞試驗(yàn)結(jié)果相似，具體原因有待進(jìn)一步研究。