地衣芽孢桿菌8147和干酪乳桿菌8149，由漳州大北農(nóng)農(nóng)牧科技有限公司研發(fā)實(shí)驗(yàn)室前期分離自健康豬腸道，已提交中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)分別為CGMCC No.8147和CGMCC No.8149。

根據(jù)公司依托的國(guó)家飼用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)和發(fā)酵飼料研發(fā)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，采用玉米面、豆粕和細(xì)麩3種飼料原料作為發(fā)酵原料，比例為20%、20%和60%，地衣芽孢桿菌8147和干酪乳桿菌8149接種比例1：1、料液比2.5：1、總接種量8%、發(fā)酵溫度33℃。

粗蛋白和酸溶蛋白的測(cè)定按照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 6432—2018》和《GB/T 22492—2008》。飼料中大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白含量、胰蛋白酶抑制因子的測(cè)定均采用酶聯(lián)免疫法，試劑盒由北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司提供?；罹鷶?shù)測(cè)定采用梯度稀釋涂布平板方法?？偹岬臏y(cè)定準(zhǔn)確稱取發(fā)酵飼料樣品約0.5g，置于250mL三角瓶中，加入100mL蒸餾水，60℃水浴30min，過濾取40mL上清液，加入2~3滴酚酞指示劑，用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定至終點(diǎn)。根據(jù)以下公式計(jì)算總酸含量：總酸（%）=[(V₂-V₁)×C×0.09008]/(M×0.4)×100

式中：V₁、V₂為空白和試樣滴定時(shí)氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）；M為樣品質(zhì)量（g）；C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（0.01mol/L）。

乙酸的測(cè)定準(zhǔn)確稱取約2.5g發(fā)酵飼料樣品，置于250mL三角瓶中，加50mL蒸餾水，滴加0.5mL酚酞指示液，用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定至終點(diǎn)，溶液由無色變?yōu)榉奂t色，30s內(nèi)不褪色。根據(jù)以下公式計(jì)算乙酸含量：乙酸（%）=[(V₂-V₁)×C×0.06005]/M×100

式中：V₁、V₂為空白和試樣滴定時(shí)氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）；M為樣品質(zhì)量（g）；C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（1mol/L）。

丙酸的測(cè)定按照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 17815—2018》的方法進(jìn)行。pH值的測(cè)定將1g樣品溶于10 mL蒸餾水中，6000 r/min 離心5min，測(cè)定上清液的pH值。乳酸的測(cè)定使用南京建成生物科技研究中心的酶學(xué)測(cè)定試劑盒。蛋白質(zhì)分布檢測(cè)利用SDS-PAGE法。

本試驗(yàn)采用的抑菌活性檢測(cè)方法在平板擴(kuò)散方法的基礎(chǔ)上做了一些改進(jìn)。具體步驟為：在平板內(nèi)倒入約3mL培養(yǎng)基（瓊脂含量為1.5%）作下層，待其凝固后放上3個(gè)無菌牛津杯。在5mL培養(yǎng)基（瓊脂含量為0.8%，30~40℃）中加入100μL指示菌后倒入平板，待其冷卻10min后，將牛津杯拔出，即可形成3個(gè)小孔。用移液槍在小孔中加樣，每孔加入50μL樣品，然后將平板置于37℃培養(yǎng)12~24h，觀察小孔周圍是否出現(xiàn)抑菌圈。抑菌圈的直徑比加樣孔=大至少1=mm才可以鑒定樣品有抑菌活性。

選取35日齡左右（10.0±0.56）kg三元仔豬300頭，隨機(jī)分成2組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25頭豬，以欄為單元。對(duì)照組仔豬飼喂大北農(nóng)保育樂乳豬飼料，試驗(yàn)組仔豬飼喂添加10%發(fā)酵飼料的對(duì)照組飼料，試驗(yàn)期30d。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel 2013作初步處理，用 SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

由表1可知，發(fā)酵后飼料中活菌數(shù)量大于5×10⁶CFU/g，提示發(fā)酵菌株可以利用飼料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行增殖。飼料原料經(jīng)發(fā)酵后，pH值由5.41下降到4.36，總酸則由0.78上升到2.95，乳酸和乙酸由未檢出分別上升到19582.85和3936.13mg/kg。飼料粗蛋白含量由24.13%上升到25.35%，酸溶蛋白含量由4.79%上升到5.96%。同時(shí)，蛋白電泳結(jié)果表明，發(fā)酵后飼料中小肽種類明顯增加（見圖1）。

由表2可知，飼料原料經(jīng)發(fā)酵后，飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量均顯著下降（P<0.05），其中，大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子含量分別下降了70.2%、76.9%和79.9%。

由圖2可知，發(fā)酵飼料對(duì)常見病原菌均有一定的抑制效果，對(duì)大腸桿菌K88、大腸桿菌K99、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均超過10mm。

由表3可知，試驗(yàn)組仔豬的日采食量較對(duì)照組略有提高，但差異不顯著（P>0.05）。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組仔豬末重顯著提高（P<0.05），日增重極顯著提高（P<0.01），料重比和腹瀉率顯著降低（P<0.05），表明發(fā)酵飼料可以顯著降低斷奶仔豬腹瀉率，同時(shí)顯著改善生產(chǎn)性能。

本試驗(yàn)通過優(yōu)化培養(yǎng)基中的碳源、氮源和無機(jī)鹽等發(fā)酵組分，建立了一套低成本、高密度的發(fā)酵小試工藝，發(fā)酵液可達(dá)目標(biāo)活菌數(shù)>10¹⁰CFU/mL，研究成果已獲得國(guó)家發(fā)明專利授權(quán)ZL201410807046.4。本研究將這2株益生菌用于高效呼吸袋發(fā)酵，通過優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)，研制了一種乳仔豬專用功能性發(fā)酵飼料。本試驗(yàn)中，飼料經(jīng)地衣芽孢桿菌8147和干酪乳桿菌8149組成的復(fù)合菌發(fā)酵后，粗蛋白含量明顯提高，可能是因?yàn)槲⑸锬軐暳显现械牡鞍踪|(zhì)、非蛋白氮、培養(yǎng)基中的無機(jī)氮及抗?fàn)I養(yǎng)因子等各種物質(zhì)分解利用轉(zhuǎn)化，合成自身高質(zhì)量的菌體蛋白，使飼料中粗蛋白含量增加；也可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中微生物生長(zhǎng)代謝消耗了部分有機(jī)物，營(yíng)養(yǎng)成分中的粗蛋白相對(duì)含量增加。任莉等報(bào)道，豆粕經(jīng)發(fā)酵后pH值下降、氣味酸香、色澤較好，且粗蛋白和粗脂肪含量均有一定程度的上升。Chi等報(bào)道，豆粕經(jīng)解淀粉芽孢桿菌、乳酸菌、植物乳酸菌和啤酒酵母菌發(fā)酵后，粗蛋白含量分別增加了6.42％、0.95％、1.91％和5.61％。劉劍飛報(bào)道，豆粕經(jīng)釀酒酵母、植物乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌組成的混合菌發(fā)酵后，有機(jī)酸含量達(dá)到2.2%，干樣pH值由6.89下降到5.32，粗蛋白含量高達(dá)53.5%。馬文強(qiáng)等報(bào)道，豆粕經(jīng)釀酒酵母菌、乳酸菌和枯草芽孢桿菌組成的混合菌發(fā)酵后，粗脂肪和粗蛋白含量分別提高了18.2%和13.5%。

飼料原料經(jīng)過發(fā)酵之后，經(jīng)過了一系列的理化反應(yīng)，復(fù)雜的大分子蛋白質(zhì)會(huì)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿与暮陀坞x氨基酸，同時(shí)產(chǎn)生大量營(yíng)養(yǎng)豐富的菌體蛋白及代謝產(chǎn)物。陳潔梅等利用芽孢桿菌對(duì)豆粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵后樣品中大豆肽含量從1.8％提高到29.5％，游離氨基酸含量從5.6增加到92.7mg/g。本研究中，發(fā)酵飼料中酸溶蛋白含量和小肽種類均明顯增加，與上述研究結(jié)果一致。鄭麗等繪制了發(fā)酵豆粕的X-衍射圖，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵可以顯著提高豆粕蛋白中的β-折疊結(jié)構(gòu)，而β-折疊結(jié)構(gòu)的比例與大豆蛋白溶解度呈正相關(guān)。大豆肽因其聚合度小比大豆蛋白更容易吸收，且小肽之間的轉(zhuǎn)運(yùn)無競(jìng)爭(zhēng)性抑制，轉(zhuǎn)化利用率高，有利于動(dòng)物蛋白質(zhì)合成。

生物發(fā)酵處理可消除或降低飼料原料中的某些抗?fàn)I養(yǎng)因子，如抗原蛋白、胰蛋白酶抑制劑、植酸、凝集素等，改善動(dòng)物對(duì)飼料的利用，提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能。研究表明，芽孢桿菌很好地去除飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子。解淀粉芽孢桿菌能降解豆粕中包括抗原蛋白在內(nèi)的多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，利用枯草芽孢桿菌E20發(fā)酵豆粕，能去除部分抗原蛋白。劉海燕研究表明，乳酸菌發(fā)酵豆粕能顯著降低抗原蛋白的含量。本研究中，飼料經(jīng)發(fā)酵后大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子含量分別下降了70.2%、76.9%和79.9%，改善了飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

研究表明，生物發(fā)酵飼料能提高仔豬的采食量、生長(zhǎng)性能和飼料利用率，降低腹瀉率。胡新旭等利用枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌和釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)的生物飼料飼喂9.5kg左右的仔豬，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，20%發(fā)酵飼料組仔豬日增重提高6.37%，料重比降低5.54%，腹瀉率顯著降低63.63%。肖軻采用乳酸菌發(fā)酵的全價(jià)料飼喂25kg左右的生長(zhǎng)育肥豬，各組豬日采食量無顯著差異，7.5%添加組豬的末重和日增重顯著提高，料重比和腹瀉率顯著降低。本研究中，飼喂生物飼料仔豬的采食量有所上升，日增重極顯著提高，料重比與腹瀉率顯著降低，與上述研究結(jié)果一致，表明地衣芽孢桿菌8147和干酪乳桿菌8149復(fù)合發(fā)酵飼料可以顯著降低斷奶仔豬腹瀉率，顯著提高生產(chǎn)性能。究其原因，飼料經(jīng)生物發(fā)酵后理化性質(zhì)發(fā)生了改變，小肽含量明顯上升，顯著改善仔豬對(duì)養(yǎng)分的消化率和飼料利用率，從而提高了各項(xiàng)生長(zhǎng)性能指標(biāo)。另外，飼料發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量乳酸、乙酸、丙酸等有機(jī)酸，pH值明顯下降，起到了酸化劑的作用，可刺激仔豬唾液的分泌并增進(jìn)動(dòng)物的食欲，而且有機(jī)酸具有獨(dú)特的酸香味可提高飼料的適口性。飼料中的有機(jī)酸還能抑制腸道潛在病原菌增殖，改善腸道菌群平衡，降低腹瀉率，進(jìn)一步改善了動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。

利用地衣芽孢桿菌8147和干酪乳桿菌8149復(fù)合發(fā)酵生產(chǎn)生物飼料，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值明顯提升，抗?fàn)I養(yǎng)因子含量顯著下降，可以顯著提高仔豬的生長(zhǎng)性能。