微生物發(fā)酵爆破秸稈降解纖維素的研究
木質纖維素是地球上數量最大的可再生能源物質，據初步統計，全世界每年產量大約為100億t，其中農作物秸稈的產量為70億t。然而，植物細胞壁中半纖維素和木質素的復雜結構及其對纖維素的包裹作用限制了秸稈資源在畜牧業(yè)生產中的大量應用。目前，在工業(yè)和飼料生產中實際使用的秸稈大約占總量的30％，其余大部分都被直接燃燒或丟棄，造成了很大的資源浪費和環(huán)境污染。因此，促進秸稈中纖維成分的降解，合理地利用秸稈資源，對于畜牧業(yè)生產和經濟發(fā)展具有非常重要的意義。
生物處理是一種安全、環(huán)境友好、低能耗的傳統的秸稈處理方法。然而，較低的水解效率和較長的反應時間限制了其在實際生產中的應用。為了提高生物處理的效果，必須采取一些物理或化學的預處理方法來軟化或破壞木質纖維素的結構。蒸汽爆破是采用飽和水蒸汽加熱原料至一定的壓力，然后驟然減壓至大氣壓的生物質預處理手段。蒸汽爆破預處理可使原料中大部分半纖維素、少量木質素和纖維素降解而溶出，有利于后續(xù)纖維素酶對纖維素的降解，是玉米秸稈預處理的有效方法之一，規(guī)?；纳a可以節(jié)省能耗和成本。許多研究表明，蒸汽爆破處理可以提高動物對谷物秸稈的消化率。目前，國內外將秸稈爆破技術應用到動物飼料生產方面的研究較少。鑒于此，將秸稈爆破預處理和微生物發(fā)酵相結合，并對爆破秸稈微生物發(fā)酵生產動物飼料的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，旨在為秸稈飼料資源的開發(fā)及其在畜牧業(yè)生產中的應用提供參考。
1材料與方法
1.1 試驗材料
玉米秸稈經粉碎機粉碎后，過5 mm篩備用。試驗所用米曲霉菌種為河南農業(yè)大學動物營養(yǎng)與生物技術實驗室分離、鑒定和保存。
1.2試驗設備
秸稈蒸汽爆破機為LB系列數控立式連續(xù)汽爆機。
1.3 試驗方法
1.3.1 原料預處理
玉米秸稈在秸稈爆破機中于2.5 MPa下維壓200 S，然后在0.008 75 s內突然釋放壓力，進行爆破預處理，處理后的樣品自然晾曬于燥備用。
1.3.2 種曲的制備和培養(yǎng)
將分離純化后的米曲霉菌株接種到PDA培養(yǎng)基中，30℃條件下靜止培養(yǎng)3 d，然后用無菌加有吐溫的生理鹽水沖洗平板，輕輕將瓊脂平面上的孢子刮下，轉移到已經滅菌的三角瓶中，采用平板計數法計算種曲孢子密度為1×106個/mL左右。
1.3.3 試驗設計與分組
正交試驗設計見表1。
營養(yǎng)液的配比為：尿素25％、葡萄糖25％、磷酸二氫鉀12.5％、硫酸鎂12.5％、硫酸錳10％、硫酸鋅10％、氯化鈷5％。
以上培養(yǎng)基用2％的Ca(OH)：諷整pH值為中性后，121℃高壓滅菌15 min，按照固液比1：1.5，接種量為4％進行接種，30℃培養(yǎng)6 d，測定發(fā)酵后產品的纖維素降解率、濾紙酶活性和羧甲基纖維素(CMC)酶活性。
1.3.4 理化指標的測定
發(fā)酵后的秸稈樣品，在50℃條件下烘干至恒質量，一部分用于測定秸稈中纖維素含量。另取4.0 g發(fā)酵樣品，加入36 mL生理鹽水浸泡2 h后，3 000 r/min離心10 min，取上清液作為粗酶液，測定其濾紙酶活性和CMC酶活性。
秸稈中纖維含量的測定采用范氏(Van Soest)纖維測定方法。
濾紙酶活性的測定：取粗酶液和煮沸10 min滅活的酶液各0.5 mL，加入1.5 mL濃度為0.05mol/L、pH值為4.5的檸檬酸緩沖液和50 mg濾紙條，于50℃條件下水浴保溫1 h，然后加入1.5 mL的DNS顯色液，煮沸5 min，以滅活酶組為對照，在波長550 nm處測定吸光度。酶活性單位定義為：以水解反應每小時催化底物水解形成1 μmol葡萄糖的酶量為1個單位。
CMC酶活性的測定：取粗酶液和煮沸10 min滅活的酶液各0.5 mL，加入1.5 mL質量分數為0.51％的CMC檸檬酸緩沖液中，在50℃恒溫水浴鍋中酶解30 min，加入1.5 mL DNS顯色液終止反應，充分混勻后，沸水浴15 min，以滅活酶組為對照，在波長550 nm處測定吸光度。
1.4 數據統計和分析
試驗數據均以“平均值±標準差”(mean±SD)表示，結果用SAS統計軟件中ANOVA過程進行方差分析，并進行Duncan多重比較，P<0.05為差異顯著。
2結果與分析
2.1 發(fā)酵爆破玉米秸稈中纖維素降解最優(yōu)培養(yǎng)基的確定
由表2可知，秸稈發(fā)酵纖維素降解率最高的條件為：爆破玉米秸稈83.5％、玉米5.0％、麩皮2.5％、豆粕5.0％、營養(yǎng)液4.0％。營養(yǎng)液的R值最高，其次為麩皮和豆粕，玉米的R值最小，表明培養(yǎng)基成分對纖維素降解的影響程度依次為營養(yǎng)液、麩皮、豆粕和玉米，營養(yǎng)液是影響纖維素降解的最主要因素。
由表3可知，營養(yǎng)液、豆粕和玉米的不同水平對纖維素降解的影響達到了極顯著水平(P
2.2 發(fā)酵爆破玉米秸稈中濾紙酶活性最優(yōu)培養(yǎng)基的確定
由表4可知，玉米、麩皮、豆粕、營養(yǎng)液的最高κ值分別在水平3、水平2、水平3、水平3。培養(yǎng)基中成分對濾紙酶產生的影響程度依次為營養(yǎng)液、麩皮、玉米和豆粕，營養(yǎng)液是影響濾紙酶產生的最主要因素。
由表5可知，營養(yǎng)液和麩皮的不同比例對濾紙酶活性的影響達到了顯著水平(P
2.3 發(fā)酵爆破玉米秸稈中CMC酶活性最優(yōu)培養(yǎng)基的確定
CMC酶活性優(yōu)化培養(yǎng)基為：爆破玉米秸稈86.0％、玉米2.5％、麩皮2.5％、豆粕5.0％、營養(yǎng)液4.0％。營養(yǎng)液的R值最高，其次為豆粕和玉米，麩皮的R值最小，這表明培養(yǎng)基成分對CMC酶活性產生的影響程度依次為營養(yǎng)液、豆粕、玉米和麩皮，營養(yǎng)液是影響CMC酶產生的最主要因素。
由表7可知，營養(yǎng)液、豆粕、玉米和麩皮的不同比例對CMC酶活性的影響均達到了顯著水平(P<0.05)。
3討論
本試驗中，纖維素降解率最高的組合為A3B2G3D3，濾紙酶和CMC酶活性產生最高的組合分別為A3B2C3D3和A2B2C3D3。濾紙酶活性產生最高的組合，纖維素的降解率也最高。
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