導(dǎo)讀

1.1 試驗(yàn)材料

酸性、中性和堿性蛋白酶均購自山東隆科特酶制劑有限公司。酸性蛋白酶：產(chǎn)自黑曲霉，活性100000U/g，有效pH為2.0～6.0，最適pH為2.5～3.5；中性蛋白酶：產(chǎn)自枯草芽孢桿菌，活性100000U/g，有效pH為5.5～8.5，最適pH為6.8～7.0；堿性蛋白酶：產(chǎn)自地衣芽孢桿菌，活性200000U/g，有效pH為6.0～11.0，最適pH為9.5～10.5。

1.2 試驗(yàn)飼糧與營養(yǎng)水平

試驗(yàn)所用的飼糧配方參照NRC（1998）并結(jié)合蘇淮豬的營養(yǎng)特點(diǎn)設(shè)計(jì)而成，試驗(yàn)料為機(jī)配粉狀料?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，選擇健康、平均體重為（9.24±0.84）kg的蘇淮斷奶仔豬120頭，按體重、性別基本一致的原則隨機(jī)分為4組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5頭豬。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加0.2g/kg酸性蛋白酶、0.2g/kg中性蛋白酶和0.1g/kg堿性蛋白酶的飼糧。試驗(yàn)預(yù)試期5d，正試期45d。試驗(yàn)豬舍為封閉式豬舍，豬欄為半漏縫地板式。飼養(yǎng)管理方式采用常規(guī)方式（每天喂料3次，分別為07：00、14：00和17：00），定期消毒、免疫、驅(qū)除蚊蟲，試驗(yàn)豬自由采食和飲水。

1.4 樣品采集與指標(biāo)測定

1.4.1 生長性能

于正試期第1天和最后1天08：00空腹稱重，得到平均初重和平均末重，計(jì)算出每頭豬的平均日增重（ADG）；每周準(zhǔn)確記錄每組飼糧的投放量和剩余量，計(jì)算出每頭豬的平均日采食量（ADFI）；根據(jù)ADG和ADFI計(jì)算F/G。

1.4.2 血清生化指標(biāo)

于試驗(yàn)最后1天晨飼前進(jìn)行采血，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取2頭仔豬（公母各1頭）從頸靜脈采血10mL，采血后立即3000r/min離心20min，取血清裝入1.5mLEP管內(nèi)，-20℃冷凍保存，待測。血清生化指標(biāo)測定方法：采用雙縮脲終點(diǎn)法檢測總蛋白（TP）含量；采用溴甲酚綠比色法檢測白蛋白（ALB）含量；采用分光光度法檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性；采用酶劑法檢測甘油三酯（TG）含量；采用脲酶法檢測尿素氮（UN）含量。上述指標(biāo)測定所用試劑盒。

1.4.3 腹瀉率與糞便指數(shù)

試驗(yàn)開始后以每個(gè)重復(fù)為單位，每天觀察記錄每欄仔豬的腹瀉情況并進(jìn)行糞便評分，評分標(biāo)準(zhǔn)：外觀條形或粒狀為正常，評分記0；軟糞，能成形為輕度腹瀉，評分記1；稠狀，不成形，糞水無分離現(xiàn)象為中度，評分記2；液狀，不成形，糞水有分離現(xiàn)象為嚴(yán)重，評分記3。當(dāng)仔豬糞便評分≥2時(shí)，開始使用抗生素或止瀉藥進(jìn)行治療。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)計(jì)算腹瀉率與糞便指數(shù)，用腹瀉率、糞便指數(shù)等指標(biāo)反映腹瀉程度。腹瀉相關(guān)計(jì)算公式：

腹瀉率＝100×腹瀉頭數(shù)/總頭數(shù)（單個(gè)重復(fù)的總頭數(shù)）；

糞便指數(shù)＝糞便評分之和/總頭數(shù)。

1.4.4 營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率

于試驗(yàn)結(jié)束前1周進(jìn)行消化試驗(yàn)，為期7d，其中3d適應(yīng)期，4d試驗(yàn)期。每個(gè)重復(fù)選取1頭進(jìn)行全收糞，記錄每日采食量、每日產(chǎn)糞總重。每天收集100g糞便，加入10mL10％硫酸溶液混勻冷凍保存，結(jié)束后再將4d的糞樣混勻，-20℃冷凍保存，待測。測定飼糧中和糞樣中的干物質(zhì)（DM）、有機(jī)物（OM）、粗蛋白質(zhì)（CP）和粗脂肪（EE）含量。營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率計(jì)算公式：

營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率（％）＝100×［食入的營養(yǎng)物質(zhì)含量（g）-糞中該物質(zhì)含量（g）］/食入的營養(yǎng)物質(zhì)含量（g）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Excel 2003進(jìn)行初步處理后，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件的ANOVA過程進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著則用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P＜0.05作為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.1 3種蛋白酶對斷奶仔豬生長性能的影響

由表2可知，酸性蛋白酶組（Ⅰ組）的ADG和ADFI均顯著高于對照組（P＜0.05），F(xiàn)/G低于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）；堿性蛋白酶組（Ⅲ組）的ADG顯著高于對照組（P＜0.05），F(xiàn)/G顯著低于對照組（P＜0.05）；中性蛋白酶組（Ⅱ組）的ADG高于對照組，F(xiàn)/G低于對照組，但差異均不顯著（P＞0.05）。

3.1 3種蛋白酶對斷奶仔豬生長性能的影響

幼齡動(dòng)物的胃腸道發(fā)育不完善，哺乳仔豬斷奶后，體內(nèi)消化酶活性大幅度降低，如胃蛋白酶等，故在飼糧中添加外源蛋白酶尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，將含有酸性蛋白酶的飼用復(fù)合酶添加到保育豬飼糧中，增強(qiáng)了腸道相關(guān)消化酶的活性，提高了保育豬的生長性能。本試驗(yàn)中，各試驗(yàn)組的生長性能均優(yōu)于對照組，這與的結(jié)果一致，其中Ⅰ組的末重、ADG和ADFI都顯著高于對照組，F(xiàn)/G降低了4.78％；Ⅱ組的末重、ADG和ADFI較對照組分別提高5.81％、8.80％和4.27％，F(xiàn)/G較對照組降低4.07％；Ⅲ組的ADG顯著高于對照組，末重和ADFI較對照組分別提高3.63％和2.56％，F(xiàn)/G顯著低于對照組。本試驗(yàn)中，Ⅰ組的末重較Ⅱ組和Ⅲ組分別提高了2.63％和4.80％，ADG較Ⅱ組和Ⅲ組分別提高了4.35％和1.94％，ADFI較Ⅱ組和Ⅲ組分別提高了3.28％和5.00％，可見酸性蛋白酶在生長性能方面的效果優(yōu)于中性蛋白酶和堿性蛋白酶，這與盧晨等的試驗(yàn)中中性蛋白酶優(yōu)于酸性蛋白酶的研究結(jié)果不一致。原因可能是本試驗(yàn)采用的蛋白酶均為普通粉劑，未做任何包被處理，只有酸性蛋白酶可以適應(yīng)胃液的酸性條件，能優(yōu)先發(fā)揮作用，使飼糧中CP在胃中初步消化分解的作用增強(qiáng)，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)在小腸內(nèi)的消化吸收；而中性和堿性蛋白酶不能適應(yīng)胃部酸性環(huán)境，被部分破壞分解，酶活降低，使得效果低于酸性蛋白酶。且本試驗(yàn)酶活水平較盧晨等試驗(yàn)酶活水平高一個(gè)數(shù)量級，極大地補(bǔ)充了胃蛋白酶的不足，增強(qiáng)了胃消化功能。在自由采食條件下，仔豬未完善的消化系統(tǒng)難以充分消化攝入的營養(yǎng)物質(zhì)，酸性蛋白酶可增強(qiáng)胃的消化功能，降低小腸的消化負(fù)擔(dān)，提高生長性能。

3.2 3種蛋白酶對斷奶仔豬營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬飼糧中添加含有蛋白酶的復(fù)合酶，可以提高CP的消化率，最佳可提高1.52％，并且指出蛋白酶是斷奶仔豬酶制劑配方的首選成分。本試驗(yàn)中，Ⅰ組的CP表觀消化率較對照組提高5.32％，較Ⅱ組和Ⅲ組分別提高4.99％和3.72％。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組DM表觀消化率分別較對照組提高6.14％、3.22％和5.79％，Ⅰ組和Ⅲ組又顯著高于Ⅱ組；Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組OM表觀消化率較對照組提高4.81％、2.22％和4.38％，Ⅰ組和Ⅲ組也顯著高于Ⅱ組；從數(shù)據(jù)可以看出，Ⅰ組的DM表觀消化率、OM表觀消化率和CP表觀消化率都高于Ⅱ組和Ⅲ組。本試驗(yàn)中各試驗(yàn)組的CP表觀消化率較對照組均有提高，這與結(jié)果一致。有研究表明，蛋白酶使用可提高CP和氨基酸在回腸的消化率，在試驗(yàn)中，營養(yǎng)物質(zhì)消化率也獲得提高。外源添加蛋白酶也可能因作用位點(diǎn)等方面的不同，將一些動(dòng)物內(nèi)源蛋白酶難以消化的蛋白質(zhì)水解為肽和氨基酸，進(jìn)而提高動(dòng)物對飼糧CP的消化率。單一蛋白酶制劑在畜禽行業(yè)內(nèi)的使用較少，但單一酶的使用可以更好地對比酶的作用效果，還可探究單一酶在動(dòng)物不同的生長時(shí)期的添加水平，更詳細(xì)地分析不同時(shí)期的消化代謝特點(diǎn)。育肥豬比仔豬具有完善的消化功能，可以很好地消化營養(yǎng)物質(zhì)，使得蛋白酶在仔豬上的使用效果優(yōu)于育肥豬。

3.3 3種蛋白酶對斷奶仔豬腹瀉情況的影響

斷奶仔豬由于應(yīng)激導(dǎo)致消化系統(tǒng)紊亂，消化酶分泌的不足進(jìn)一步影響斷奶仔豬的消化能力，從而降低仔豬健康狀況。添加酶制劑可彌補(bǔ)內(nèi)源消化酶分泌的不足，幫助消化腸道內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)，減少過敏反應(yīng)的發(fā)生，降低腹瀉率。郭建來等在探究酸性蛋白酶對仔豬生長性能和養(yǎng)分表觀消化率的影響時(shí)對仔豬的腹瀉情況也進(jìn)行了記錄，酸性蛋白酶組的腹瀉率較對照組降低了65.47％，減少腹瀉效果明顯。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組的腹瀉率和糞便指數(shù)均低于對照組，在試驗(yàn)第31～45天時(shí)期試驗(yàn)組的腹瀉率和糞便指數(shù)與對照組有最明顯差異。其中，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組的腹瀉率分別比對照組低70.44％、76.67％和77.78％，糞便指數(shù)分別比對照組低56.00％、66.73％和75.82％；而Ⅱ組的腹瀉率和糞便指數(shù)分別比Ⅰ組降低了21.05％和24.81％；Ⅲ組的腹瀉率和糞便指數(shù)分別比Ⅱ組降低了4.76％和27.32％。可以看出中性蛋白酶和堿性蛋白酶的防治腹瀉效果優(yōu)于酸性蛋白酶，推測是由于中性蛋白酶和堿性蛋白酶在腸道中發(fā)揮的作用更明顯。斷奶仔豬飼糧為高蛋白質(zhì)飼糧，斷奶早期的仔豬消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的發(fā)育均不完善，腸道微生物區(qū)系平衡尚未建立，會(huì)對飼糧中的CP產(chǎn)生消化障礙，未消化的蛋白質(zhì)進(jìn)入腸道后段被細(xì)菌降解成胺類等有害物質(zhì)，造成仔豬營養(yǎng)性腹瀉。同時(shí)腸道對飼糧抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)，引起腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷性變化，破壞仔豬腸道的免疫功能，引起腸道局部過敏反應(yīng)，加劇仔豬營養(yǎng)性腹瀉的爆發(fā)。中性蛋白酶的最適pH為6.8～7.0，更適應(yīng)小腸內(nèi)的pH條件。中性蛋白酶進(jìn)入小腸后補(bǔ)充了胰蛋白酶分泌的不足，促進(jìn)胰蛋白酶對腸道內(nèi)蛋白質(zhì)的分解，減少抗原引起的免疫應(yīng)激，有效降低營養(yǎng)性腹瀉的發(fā)生。據(jù)報(bào)道，大豆副產(chǎn)品中抗?fàn)I養(yǎng)因子的殘留量很高，如豆粕、膨化豆粕，而膨化大豆經(jīng)高溫雖然可以去除熱敏性的抗?fàn)I養(yǎng)因子，但無法去除豆粕中熱穩(wěn)定性的大豆抗原蛋白等抗?fàn)I養(yǎng)因子，使其成為造成仔豬營養(yǎng)性腹瀉的一大因素。有研究發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶不僅可以改善豆粕中大豆蛋白的溶解性，也能快速地將大部分大豆抗原蛋白降解為21ku以下的肽，很好地改善了豆粕的使用安全性。亦有報(bào)道認(rèn)為枯草芽孢桿菌分泌的中性蛋白酶可以降解大豆蛋白，提高CP消化率，是枯草芽孢桿菌益生作用的機(jī)理之一。堿性蛋白酶在腸道內(nèi)雖不能達(dá)到最適酶活條件，但弱堿性環(huán)境處于其能發(fā)揮酶活條件內(nèi)。堿性蛋白酶能更好地降解飼糧中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，如抗原蛋白等，大分子、難降解的蛋白質(zhì)經(jīng)堿性蛋白酶的降解變成小分子的肽進(jìn)入組織內(nèi)，減少了飼糧中抗?fàn)I養(yǎng)因子引起的仔豬腸道免疫反應(yīng)，從而達(dá)到防治營養(yǎng)性腹瀉的效果。

3.4 3種蛋白酶對斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

在研究角蛋白酶對仔豬生長性能、血清生化指標(biāo)及抗氧化指標(biāo)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)外源添加角蛋白酶可顯著降低血清中ALT的活性。ALT和AST主要存在于細(xì)胞液中，在心臟和肝臟組織中含量較高。轉(zhuǎn)氨酶活性可反映肝臟結(jié)構(gòu)和功能完整性，當(dāng)肝臟受損時(shí)，大量的轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)入血中導(dǎo)致血清中轉(zhuǎn)氨酶含量偏高。本試驗(yàn)中，Ⅱ組血清AST活性顯著高于對照組、Ⅰ組和Ⅲ組，與相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果不一致，原因尚不清楚。本試驗(yàn)Ⅰ組血清UN含量顯著低于對照組，血液中的尿素是通過鳥氨酸循環(huán)合成的，是蛋白質(zhì)分解的最終產(chǎn)物，可以反映蛋白質(zhì)的代謝。單胃動(dòng)物血清UN含量與飼糧的氮利用率成反比，可以衡量飼糧蛋白質(zhì)的生物學(xué)價(jià)值，UN含量越低表明飼糧蛋白質(zhì)的利用率越高。本試驗(yàn)中，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組中血清TP含量較對照組分別提高了1.69％、2.78％、2.42％，但差異不顯著。而TP有運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)、維持滲透壓，參與體液免疫的功能，TP含量升高可增強(qiáng)營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)平衡。