摘要：

為了提高桑葉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，進(jìn)行了發(fā)酵桑葉的工藝優(yōu)化研究。以發(fā)酵桑葉粗蛋白質(zhì)和單寧含量為指標(biāo)，以桑葉與麩皮質(zhì)量比、菌種組合、接種量和發(fā)酵時(shí)間為影響因素，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，以確定最佳發(fā)酵條件。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)和對(duì)比試驗(yàn)。結(jié)果表明:1)正交試驗(yàn)優(yōu)化組合為，桑葉與麩皮質(zhì)量比為9∶1，菌種組合為酒窖片球菌+地衣芽孢桿菌，接種量為2%，發(fā)酵時(shí)間為4d。2)驗(yàn)證試驗(yàn)表明，優(yōu)化組合發(fā)酵桑葉測(cè)得粗蛋白質(zhì)含量為26.18%，單寧含量為4.73g/kg，均優(yōu)于正交試驗(yàn)表中最優(yōu)值。3)對(duì)比試驗(yàn)表明，與未發(fā)酵桑葉相比，發(fā)酵桑葉粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分、磷含量顯著提高(P＜0.05)，單寧、中性洗滌纖維、碳水化合物含量和PH顯著降低(P＜0.05)。與未發(fā)酵桑葉相比，發(fā)酵桑葉精氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、總非必需氨基酸、總氨基酸含量顯著降低(P＜0.05)，而丙氨酸含量、總必需氨基酸/總氨基酸、總必需氨基酸/總非必需氨基酸顯著提高(P＜0.05)。發(fā)酵桑葉的半胱氨酸+蛋氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、酪氨酸+苯丙氨酸組成均顯著高于未發(fā)酵桑葉(P＜0.05)。由此可見(jiàn)，發(fā)酵桑葉的最佳條件是:桑葉與麩皮質(zhì)量比為9:1，菌種組合為酒窖片球菌+地衣芽孢桿菌，接種量為2%，發(fā)酵時(shí)間為4d。發(fā)酵提高了桑葉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

引言：

單寧是復(fù)雜的水溶性多酚化合物，存在于許多植物中，并可存在于樹(shù)皮、樹(shù)葉、樹(shù)干、果實(shí)和根中。單寧能夠絡(luò)合蛋白質(zhì)、氨基酸、大分子物質(zhì)，對(duì)消化酶產(chǎn)生拮抗作用，阻礙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，降低動(dòng)物的消化率；并因其苦澀的味道減少動(dòng)物的采食量，從而降低植物飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。桑葉資源豐富，富含粗蛋白質(zhì)(CP)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)，是一種較好的非常規(guī)飼料資源。但桑葉單寧含量較高，限制了其在畜牧業(yè)的應(yīng)用。因此，有效降解單寧對(duì)提升桑葉的應(yīng)用價(jià)值具有重要意義。物理加工技術(shù)可以有效地降解單寧，如高溫、浸泡、煮沸、高壓、擠壓蒸煮等。盡管上述技術(shù)可以降解一些單寧，但也可能降低桑葉營(yíng)養(yǎng)成分。另外，上述技術(shù)耗能成本較高，不利于可持續(xù)發(fā)展。因此，需要一種更合適的、高效降解桑葉單寧的技術(shù)。發(fā)酵是利用微生物將植物莖葉成分轉(zhuǎn)化為微生物蛋白、活性小肽、活性物質(zhì)的技術(shù)，能降解抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高飼料原料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。黑曲霉、地衣芽孢桿菌、酵母、乳酸菌可以高效地將高分子單寧降解為小分子物質(zhì)。柔毛鐮孢菌和球孢白僵菌等絲狀真菌發(fā)酵顯著減少了橄欖餅單寧含量。黑曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌發(fā)酵降低了辣木葉41%單寧含量，提高了44%CP含量。羅伊氏乳桿菌、乳酸片球菌、枯草芽孢桿菌發(fā)酵降低了朱纓花葉單寧含量。這些文獻(xiàn)為發(fā)酵降解桑葉單寧提供了思路。但是，關(guān)于桑葉發(fā)酵工藝的研究很少，通過(guò)發(fā)酵技術(shù)降解桑葉單寧的研究更少，尚不清楚發(fā)酵條件如何影響桑葉單寧的降解。因此，本研究通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化了提高桑葉CP含量同時(shí)降低單寧含量的發(fā)酵條件，研究了桑葉發(fā)酵基質(zhì)組成、菌種組合、接種量及發(fā)酵時(shí)間對(duì)單寧降解的影響，并且探討了發(fā)酵對(duì)桑葉營(yíng)養(yǎng)成分的影響，以期為桑葉的應(yīng)用提供參考。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：

將鮮桑葉切短(1～2cm)，按照一定比例添加麩皮混合均勻，按照所需菌種組合和接種量添加菌種并攪拌均勻，發(fā)酵基質(zhì)未滅菌，基質(zhì)pH自然狀態(tài)(不調(diào)整pH)，每個(gè)呼吸袋裝入200g發(fā)酵基質(zhì)，密封發(fā)酵。在空調(diào)房?jī)?nèi)進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為(25±1)℃。

結(jié)果：

1.正交試驗(yàn)極差分析

由表2可知，通過(guò)直觀分析方法比較表中極差大小，對(duì)CP含量影響因素大小排序?yàn)?桑葉與麩皮質(zhì)量比(A)、菌種組合(B)、接種量(C)、發(fā)酵時(shí)間(D)。根據(jù)Ki值的大小判斷最優(yōu)水平，得到各因素對(duì)CP含量的最優(yōu)組合為A1B2C2D2。同理，對(duì)單寧含量影響因素大小排序?yàn)?菌種組合(B)、發(fā)酵時(shí)間(D)、桑葉與麩皮質(zhì)量比(A)、接種量(C)，得到各因素對(duì)單寧含量的最優(yōu)組合為A1B2C2D1。綜合上述分析，桑葉發(fā)酵最優(yōu)方案為A1B2C2D1或A1B2C2D2，即桑葉與麩皮質(zhì)量比為9∶1，菌種組合為酒窖片球菌+地衣芽孢桿菌，接種量為2%，發(fā)酵時(shí)間為4或6d。

2.正交試驗(yàn)方差分析

由表3和表4可知，CP的校正模型P值為0.030＜0.05，說(shuō)明校正模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，正交試驗(yàn)結(jié)果具有可信度。桑葉與麩皮質(zhì)量比和菌種組合顯著影響發(fā)酵桑葉CP含量，說(shuō)明二者是影響發(fā)酵桑葉CP含量的主要因素。根據(jù)F值得到，對(duì)CP含量影響因素大小排序?yàn)?桑葉與麩皮質(zhì)量比、菌種組合、接種量、發(fā)酵時(shí)間。對(duì)桑葉與麩皮質(zhì)量比(A)分析，A1的CP含量顯著高于A3(P＜0.05)，A2的CP含量與A1、A3差異均不顯著(P＞0.05)，因此選擇A1。同理，菌種組合(B)選擇B2。桑葉與麩皮質(zhì)量比(A)和菌種組合(B)對(duì)CP含量的最優(yōu)組合為A1B2。同理，菌種組合和發(fā)酵時(shí)間是影響單寧含量的主要因素。菌種組合(B)和發(fā)酵時(shí)間(D)對(duì)單寧含量的最優(yōu)組合為B2D1。綜合CP和單寧含量的最優(yōu)組合，得到桑葉發(fā)酵最優(yōu)組合為A1B2CiD1。

3.對(duì)比試驗(yàn)

3.1營(yíng)養(yǎng)成分

發(fā)酵桑葉顏色黃綠，有桑葉清香，味道酸甜。由表5可知，發(fā)酵桑葉CP和EE含量分別比未發(fā)酵桑葉提高了16.82%和30.57%(P＜0.05)。發(fā)酵桑葉粗灰分和磷含量顯著高于未發(fā)酵桑葉(P＜0.05)。發(fā)酵桑葉單寧、NDF、碳水化合物含量分別比未發(fā)酵桑葉降低了56.40%、16.78%、7.29%(P＜0.05)。發(fā)酵桑葉pH顯著低于未發(fā)酵桑葉(P＜0.05)。發(fā)酵桑葉與未發(fā)酵桑葉之間DM、CF、ADF、鈣含量差異不顯著(P＞0.05)。

3.2氨基酸含量

由表6可知，與未發(fā)酵桑葉相比，發(fā)酵桑葉精氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、總非必需氨基酸、總氨基酸含量顯著降低(P＜0.05)，而丙氨酸含量、總必需氨基酸/總氨基酸(TEAA/TAA)、總必需氨基酸/總非必需氨基酸(TEAA/TNEAA)顯著提高(P＜0.05)。

3.3必需氨基酸組成

由表7可知，發(fā)酵桑葉的半胱氨酸+蛋氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、酪氨酸+苯丙氨酸組成均顯著高于未發(fā)酵桑葉(P＜0.05)。與未發(fā)酵桑葉相比，發(fā)酵桑葉纈氨酸組成有提高的趨勢(shì)(0.05≤P＜0.10)。未發(fā)酵桑葉和發(fā)酵桑葉的賴氨酸和亮氨酸組成高于雞蛋蛋白和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)模式，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸+苯丙氨酸和總必需氨基酸組成高于FAO模式，稍低于雞蛋蛋白模式，半胱氨酸+蛋氨酸組成低于雞蛋蛋白和FAO模式。由此可見(jiàn)，未發(fā)酵桑葉和發(fā)酵桑葉的必需氨基酸組成較為均衡，發(fā)酵桑葉必需氨基酸組成優(yōu)于未發(fā)酵桑葉。

結(jié)論:

發(fā)酵桑葉的最佳條件是:桑葉與麩皮質(zhì)量比為9∶1，菌種組合為酒窖片球菌+地衣芽孢桿菌，接種量為2%，發(fā)酵時(shí)間為4d。發(fā)酵提高了桑葉CP、EE、粗灰分、磷含量，降低單寧、NDF、碳水化合物、非必需氨基酸含量和pH。

本產(chǎn)品是一種以高濃度乳酸菌和酵母菌等組合酶菌結(jié)合的復(fù)合專業(yè)飼料發(fā)酵劑產(chǎn)品，可以發(fā)酵我們常見(jiàn)的大部分飼料原料、農(nóng)家飼料、農(nóng)產(chǎn)品與食品加工下腳料，制作活性EM菌液與制作青貯飼料，具有發(fā)酵、除霉、降解纖維、提高發(fā)酵飼料營(yíng)養(yǎng)與適口性且能夠長(zhǎng)時(shí)間保存等功能，具有操作簡(jiǎn)單成功率高、成本低廉等特點(diǎn)。

本產(chǎn)品符合飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)

【生產(chǎn)許可證號(hào)】桂飼添（2021）H01001

【產(chǎn)品執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)】Q/NNWR 02-2021（飼用復(fù)合微生物添加劑Ⅰ）

【適用對(duì)象】畜禽、水產(chǎn)、環(huán)保

【原料組成】酵母菌、芽孢桿菌、乳酸菌等，復(fù)合酶制劑與載體等。

【產(chǎn)品成分分析保證值】酵母菌、芽孢桿菌、乳酸菌等合計(jì)≥100億cfu/g，水分＜9.0%。

凈重：200 克/袋。

本產(chǎn)品是在活力99生酵劑的基礎(chǔ)上的升級(jí)產(chǎn)品，升級(jí)了増香增甜等功能效果。

鑒別本產(chǎn)品真假與效果的簡(jiǎn)單方法：500毫升左右的礦泉水瓶子中放入約50克大米+300毫升35℃左右的溫水，加入本產(chǎn)品5克，幾個(gè)小時(shí)就會(huì)產(chǎn)生大量香醇?xì)怏w，72小時(shí)內(nèi)大米基本溶解為乳狀。做試驗(yàn)時(shí)請(qǐng)切記要注意礦泉水瓶炸開(kāi)的安全。

產(chǎn)品使用說(shuō)明書

（一）制作加強(qiáng)型活性EM菌液

在非金屬容器中將本品1包（200克）與1公斤紅糖（也可以用5公斤大米或玉米等含淀粉類的飼料代替）放入約50公斤溫水中，簡(jiǎn)單密封48小時(shí)后就變成了加強(qiáng)型活性EM菌液（每毫升活菌在100億左右）。其使用方法如下：

1.在畜禽上的使用方法：根據(jù)不同動(dòng)物與飼養(yǎng)周期按其飼料重量的0.1%-0.5%拌入飼料或飲水中后飼喂或飲用。

2.養(yǎng)殖場(chǎng)緊急除臭生物消毒：取加強(qiáng)型活性EM菌液兌水30倍清水，對(duì)產(chǎn)生臭味與異味的養(yǎng)殖區(qū)域、糞污水道、糞堆、污水池進(jìn)行噴灑，以噴灑表面濕潤(rùn)為準(zhǔn)，接待參觀前1-3小時(shí)補(bǔ)噴一次效果更好。

3.制作青貯飼料：每噸青貯飼料中加入10公斤加強(qiáng)型活性EM菌液，簡(jiǎn)單噴灑在料上壓實(shí)密封發(fā)酵15天以上。

4.養(yǎng)殖水產(chǎn)上的使用：每畝使用5公斤加強(qiáng)型活性EM菌液進(jìn)行噴灑，晴天進(jìn)行噴灑后注意增氧。

（二）制作各種發(fā)酵飼料

本品能夠發(fā)酵木薯渣、豆渣、米粉面條加工下腳料、剩菜剩飯、米糠、統(tǒng)糠、菌糠、酒糟、果渣果皮、青黃秸稈、牧草、紅薯藤、輕度霉變飼料等各種廉價(jià)飼料（下腳料）、各種飼料原料與全價(jià)飼料等，每500公斤待發(fā)酵原料加入本品1-2包（或50公斤上述加強(qiáng)型活性EM菌液）、20公斤以上的玉米粉或其它含淀粉類的飼料原料、1公斤食鹽（含有足夠食鹽的原料就不添加），含水量調(diào)節(jié)到約60%，壓實(shí)密封發(fā)酵2-7天左右有濃郁香味時(shí)即可使用。發(fā)酵后飼料的適口性、營(yíng)養(yǎng)、消化率較未發(fā)酵前有明顯提升。發(fā)酵后的飼料根據(jù)不同動(dòng)物與不同飼養(yǎng)周期按照10%-50%與該動(dòng)物其它全價(jià)飼料混合后飼喂（先少量飼喂適應(yīng)后逐漸增加的原則），不可以單獨(dú)飼喂或全部飼喂發(fā)酵飼料。

（三）發(fā)酵水產(chǎn)動(dòng)物飼料成高濃度乳酸菌保健品

①部分發(fā)酵飼料運(yùn)用：100公斤水產(chǎn)飼料、50公斤清水、本品1包密封發(fā)酵7天以上變成高濃度乳酸菌發(fā)酵飼料，以10%比例與水產(chǎn)動(dòng)物飼料混合后飼喂，或者發(fā)酵飼料單獨(dú)飼喂；②全部發(fā)酵飼料飼喂：也叫輕度發(fā)酵飼料技術(shù)，300公斤水產(chǎn)全價(jià)飼料、本品1包、水120公斤混合發(fā)酵24小時(shí)全部飼喂，這種預(yù)消化結(jié)合大量乳酸菌飼喂能夠顯著改善水產(chǎn)動(dòng)物腸道健康、水質(zhì)改善等優(yōu)點(diǎn)。

（四）發(fā)酵部分禽糞做飼料

發(fā)酵雞糞（鴿子糞、兔糞等）作豬、魚等動(dòng)物飼料，本品2包、100公斤玉米粉其它含淀粉類的飼料原料、500公斤雞糞，加入適量麥麩或米糠調(diào)節(jié)含水量約為55%-60%，覆蓋薄膜進(jìn)行發(fā)酵，一周左右有濃郁香味時(shí)即可使用，可代替飼料20%左右，用于喂豬或魚類等。

（五）發(fā)酵菜粕、棉粕、花生餅、茶枯脫毒

原料1000公斤，玉米面其它含淀粉類的飼料原料100公斤，食鹽2公斤，含水量調(diào)節(jié)到55%左右，本品2包，簡(jiǎn)單地?cái)嚢杈鶆?，密封發(fā)酵15天以上成為高濃度乳酸菌小肽豐富的生物蛋白飼料，喂前攤開(kāi)透氣10分鐘再作為蛋白質(zhì)原料使用于自配飼料中，可以等蛋白代替豆粕和玉米粉如：17%的發(fā)酵菜粕=10%的豆粕+7%的玉米粉，降低成本提高使用效果。

（六）中草藥及中藥渣發(fā)酵方法

1.固態(tài)中草藥發(fā)酵技術(shù)：將50公斤中草藥粉碎，越細(xì)越好放入40公斤的35℃左右的溫水中，加入玉米粉與豆粕各5公斤、本品1-2包、食鹽100克，放入塑料容器內(nèi)壓實(shí)密封發(fā)酵7天以上后使用，密封可以保存一年以上，按照飼料比例的1%以上添加到飼料或飲水中使用。

2.液態(tài)中草藥發(fā)酵技術(shù)：1公斤中草藥+1包本品+1公斤紅糖+20公斤清水混合在非金屬容器中簡(jiǎn)單密封發(fā)酵72小時(shí)以上后使用。每噸飼料中添加10公斤或每噸飲水中添加5公斤。

（七）直接拌料或飲水、制粒飼喂、制作水料

根據(jù)不同動(dòng)物在每噸飼料添加本品2-4包，直接拌料或每包加入1.5-2噸飲水中使用；本產(chǎn)品采用微生物多層包被技術(shù)，在每噸3包本品混合飼料中直接制粒，90℃下5分鐘不會(huì)影響效果；動(dòng)物采用水料水料（粥料）的制作：本品1-2包、500公斤全價(jià)飼料、1000公斤清水混合后發(fā)酵6小時(shí)以上后飼喂（預(yù)消化的輕度發(fā)酵模式），24小時(shí)內(nèi)飼喂完。

（八）注意事項(xiàng)

1.發(fā)酵飼料時(shí)，請(qǐng)勿加入濃度較高抑菌劑的脫霉劑或抗生素（如土霉素），或發(fā)酵原料中帶有較強(qiáng)殺菌物質(zhì)可能導(dǎo)致發(fā)酵不成功；原料霉變稍重、發(fā)現(xiàn)發(fā)酵速度變慢或者溫度偏低，可以增加2-3倍的使用量即可解決。

2.飼料中正常添加的抗生素不會(huì)造成對(duì)本品效果的影響，但在大劑量對(duì)動(dòng)物治療期間要會(huì)影響效果但無(wú)副作用（可以間隔4小時(shí)使用）。運(yùn)用本品后的健康動(dòng)物可以減少或停用抗生素的使用。

3.特別提醒：如果是第一次制作發(fā)酵飼料、需要發(fā)酵的原料霉變或變質(zhì)較重、發(fā)酵環(huán)境溫度較低（低于15℃）、粗纖維較高、需要加快發(fā)酵速度或者需要制作出更加香醇高品質(zhì)的生物發(fā)酵飼料出來(lái)等情況，請(qǐng)按照本產(chǎn)品說(shuō)明書使用量增加2-3倍的使用量即可。

【包裝規(guī)格】200克/包，80包/箱。規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)可以提供25公斤裝或者進(jìn)行產(chǎn)品定制。

【質(zhì)保與儲(chǔ)存】12個(gè)月，常溫下于通風(fēng)、陰涼、干燥處存放。

【生產(chǎn)企業(yè)】南寧微瑞生物科技有限公司（高新區(qū)科園大道58號(hào)）

【客服電話】400-030-9099

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