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枯草芽孢桿菌B6 的特性及其對(duì)哺乳期母豬生產(chǎn)性能的影響

2019-06-04 15:49:26      點(diǎn)擊:

    文章旨在報(bào)道一株極具益生菌開(kāi)發(fā)潛力的枯草芽孢桿菌B6,通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定了該菌株高產(chǎn)功能性果聚糖的最佳碳源為蔗糖,果聚糖作為B.subtilis B6的主要功能性代謝產(chǎn)物,其胞外產(chǎn)量在100g/L以上,經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,該菌株產(chǎn)生的果聚糖具有很強(qiáng)的抗氧化作用,10 mg/m果聚糖的DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率分別為80%和71%以上,鐵還原能力達(dá)到43.26mmol/gFeSO4當(dāng)量。B.subtilis B6顯示了活菌數(shù)高,菌種性能強(qiáng),生產(chǎn)成本低等優(yōu)良的應(yīng)用特性。哺乳期母豬的飼喂效果顯示B.subtilis B6液體菌劑可使仔豬平均窩重提高28.8%,平均斷奶窩重提高18%,顯著提高母豬及仔豬免疫力。綜上,菌株B.subtilis B6作為特效益生菌在飼料添加劑領(lǐng)域?qū)⒕哂泻艽蟮拈_(kāi)發(fā)潛能和市場(chǎng)價(jià)值。


    枯草芽孢桿菌是目前畜牧養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用較為廣泛的益生菌。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )屬于革蘭氏陽(yáng)性、好氧型桿狀細(xì)菌,是公認(rèn)安全(GenerallyRecognized As Safe,GRAS)菌株。該菌種在自然界中分布廣泛,其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物種類多,抑菌活性強(qiáng)、抑菌譜廣,同時(shí)具有激活免疫、促生長(zhǎng)等功能特性,顯示了很好的飼用益生菌的應(yīng)用潛力。

    微生物來(lái)源的胞外多糖具有抗腫瘤、抗糖尿病、降血脂、提高免疫力等多種生物學(xué)功能,如來(lái)源于解淀粉芽孢桿菌的胞外多糖能夠抑制胃癌細(xì)胞MC-4和SGC-7901生長(zhǎng)活性;來(lái)源于解淀粉芽孢桿菌LPL061的多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用,其發(fā)酵產(chǎn)率為4.46g/L;Cellulomonas sp . GJT07發(fā)酵優(yōu)化后果聚糖產(chǎn)量為15g/L。

    本文以一株高產(chǎn)功能性果聚糖的枯草芽孢桿菌為研究對(duì)象,對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)果聚糖的發(fā)酵條件、果聚糖的功能活性,以及該菌株的應(yīng)用特性及其對(duì)孕期母豬的飼喂效果進(jìn)行了系統(tǒng)研究,為開(kāi)發(fā)一株具有獨(dú)特性能的新型益生菌劑奠定了良好的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1

菌種及發(fā)酵培養(yǎng)基

   枯草芽孢桿菌B6(Bacillus subtilis B6)菌株由本實(shí)驗(yàn)室篩選保存。

    發(fā)酵培養(yǎng)基成分:400g/L 蔗糖、25g/L可溶性淀粉、5g/L酵母浸粉、磷酸氫二鉀1g/L、氯化鈉10g/L、氯化鈣0.3g/L、硫酸鋅0.01g/L、硫酸亞鐵0.03g/L、硫酸錳0.1g/L和硫酸鎂1g/L。

1.2液體發(fā)酵

     ① 一級(jí)種子液制備:取甘油管中保存的菌液按照2‰的接種量接種于20 mLB 培養(yǎng)基中,37 ℃、220r/min震蕩培養(yǎng)10~12 h。

     ② 二級(jí)種子液制備:將一級(jí)種子液按照2%的接種量接種于200 mLB培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)10~12 h。

     ③ 三級(jí)種子液制備:將二級(jí)種子液接種至5 L發(fā)酵培養(yǎng)基中37 ℃、pH值7.0培養(yǎng)至DO上升。

     ④ 100L種子液制備:將三級(jí)種子液接種至100L發(fā)酵培養(yǎng)基中37 ℃、pH值7.0培養(yǎng)。罐壓0.05 MPa,通氣150~300L/min,初始轉(zhuǎn)速150 r/min。設(shè)定轉(zhuǎn)速串聯(lián)溶氧(40%),最高轉(zhuǎn)速450r/min。培養(yǎng)至溶氧開(kāi)始上升,pH值偏堿時(shí),進(jìn)行移種。

     ⑤ 1000L罐發(fā)酵:配制300L(滅菌后400 L)發(fā)酵培養(yǎng)基115 ℃滅菌。將100 L種子液移種至1000 L發(fā)酵罐中,恒溫37 ℃、pH值7.0,初始通氣800L/min(最大為1500 L/min),初始轉(zhuǎn)速150r/min(最大轉(zhuǎn)速為350 r/min)。設(shè)定轉(zhuǎn)速串聯(lián)溶氧(30%)。

    ⑥ 計(jì)數(shù)與檢測(cè):在發(fā)酵過(guò)程中每隔6h取一份菌液樣品,檢測(cè)OD600數(shù)值,以10為梯度分別稀釋至一定倍數(shù)后進(jìn)行平板涂布,放入37 ℃溫箱培養(yǎng)9 h后計(jì)數(shù)。一份直接涂布,另一份80 ℃水浴10 min以后再涂布。

1.3抗氧化能力測(cè)定

    ① ABTS 自由基清除能力測(cè)試:100μ樣品溶液與3000μ由磷酸鹽緩沖液(10mmol/,pH 值7.4)稀釋的ABTS 自由基溶液(其在734nm 處吸光值為0.70±0.02)快速混勻后,避光反應(yīng)6min,測(cè)定反應(yīng)液在734nm處的吸光度。按照公式(1)計(jì)算ABTS自由基清除率。

ABTS 自由基清除率(%)=(Ablank-Asample)/Ablank×100 ------ (1)

式中: Ablank——空白樣品吸光度;

    Asample——測(cè)試樣品吸光度。

    解淀粉芽孢桿菌果聚糖測(cè)試濃度為25 mg/mL。

    ② DPPH自由基清除能力測(cè)試:1m樣品溶液、1m由無(wú)水乙醇配制0.2 mmol/的DPPH溶液和1m二次水快速混勻后,避光反應(yīng)30 min,測(cè)定反應(yīng)液在517nm處的吸光值。按照公式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率。

DPPH 自由基清除率(%)=(Ablank-Asample)/Ablank×100------(2)

式中:Ablank——空白樣品吸光度;

     Asample——測(cè)試樣品吸光度。

     ③ 鐵還原能力測(cè)試:取100μ樣品溶液與3m鐵還原(FRAP)試劑混勻后于37 ℃水浴中反應(yīng)5min,測(cè)定593nm處吸光值。同時(shí)取濃度0~1.0 mmol/的FeSO4溶液各100μ代替樣品反應(yīng),以593nm處吸光值為縱坐標(biāo),F(xiàn)eSO4濃度為橫坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品對(duì)應(yīng)的FeSO4濃度,表示鐵還原能力。

1.4

孕期母豬飼喂實(shí)驗(yàn)

    選擇胎次接近、健康狀況良好的長(zhǎng)白哺乳母豬48頭,平均分成兩組,每組24頭,實(shí)驗(yàn)從產(chǎn)仔前30d至哺乳仔豬22日齡斷奶結(jié)束,對(duì)照組為基礎(chǔ)日糧,益生組每日添加1mB.subtilis B6液體菌劑。

結(jié)果與討論

2.1 枯草芽孢桿菌B6液體發(fā)酵高產(chǎn)果聚糖

   前期研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌B6 發(fā)酵過(guò)程中可產(chǎn)生具有良好生物活性的功能多糖,并鑒定其主要成分為果聚糖。本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步了解不同碳源對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)功能性低碳的影響,分別以400g/的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、果糖為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源,其他成分不變。以2%的接種量于37℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)24h,結(jié)果如表1所示,B.subtilis B6 發(fā)酵高效生產(chǎn)果聚糖需以蔗糖為主要的培養(yǎng)基成分,應(yīng)用優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件,發(fā)酵培養(yǎng)24h枯草芽孢桿菌活菌數(shù)達(dá)到1×10^10~1×10^11CFU/m,發(fā)酵液中功能多糖(果聚糖)含量≥100g/。如此高的果聚糖產(chǎn)量在枯草芽孢桿菌中并不多見(jiàn),也正是由于其高產(chǎn)功能多糖的代謝特性,使得B.subtilis B6顯示了良好的益生菌活性。


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    據(jù)報(bào)道果聚糖作為功能性多糖,通常具有抗氧化和抗腫瘤等生物學(xué)活性,本文應(yīng)用DPPH 自由基清除、ABTS 自由基清除與鐵還原能力指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)枯草芽孢桿菌B6 所產(chǎn)果聚糖的抗氧化活性。結(jié)果如表2 所示,隨枯草芽孢桿菌B6 果聚糖濃度的提高,其抗氧化能力隨之增強(qiáng),當(dāng)果聚糖濃度達(dá)到10mg/m,其DPPH 自由基清除率和ABTS 自由基清除率分別達(dá)到80%和70%以上,鐵還原能力也達(dá)到抗氧化劑組鐵還原能力的69.6%??梢?jiàn),枯草芽孢桿菌B6 果聚糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力,作為益生菌產(chǎn)生的重要代謝產(chǎn)物,對(duì)于清除動(dòng)物體內(nèi)自由基、提高免疫力、改善體質(zhì)、提高抗病性將具有顯著效果。

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    本文對(duì)B.subtilis B6的主要應(yīng)用性能指標(biāo)進(jìn)行了詳細(xì)測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表3所示,經(jīng)過(guò)分析,枯草芽孢桿菌B6具有活菌數(shù)高,菌種性能強(qiáng),生產(chǎn)成本低等諸多優(yōu)勢(shì)。同時(shí),該菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中可產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶等消化酶類,可加強(qiáng)宿主體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)代謝。作為益生菌應(yīng)用,B.subtilis B6也顯示了良好的抗胃酸和耐高溫等抗逆性能,其保存穩(wěn)定及有效性也很優(yōu)秀,因此,B.subtilis B6顯示了非常良好的益生菌劑開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力。

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    應(yīng)用B.subtilis B6液體菌劑飼喂哺乳期母豬,結(jié)果如表4所示,與對(duì)照組相比,飼喂B.subtilis B6液體菌劑的母豬生產(chǎn)平均健仔數(shù)相對(duì)高,弱仔及死胎率相對(duì)低,平均窩重提高了28.8%,說(shuō)明該益生菌劑對(duì)母豬生產(chǎn)具有顯著的有益效果;同時(shí),平均斷奶窩重也較對(duì)照組提高了18%,通過(guò)觀察,飼喂B.subtilis B6液體菌劑的仔豬精神相對(duì)較好,顯著緩解仔豬腹瀉,可見(jiàn)B.subtilis B6液體菌劑具有顯著提高母豬及仔豬免疫力的功效。

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    本文針對(duì)一株高產(chǎn)果聚糖的枯草芽孢桿菌B6及其應(yīng)用做了系統(tǒng)研究,該菌株作為飼用益生菌劑可產(chǎn)生功能性果聚糖作為良好的抗氧化劑,可增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力和抗病性。菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中還可產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶等消化酶類,可加強(qiáng)宿主體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)代謝。應(yīng)用該活體菌劑飼喂孕期母豬,可顯著提高窩重,仔豬精神相對(duì)更好,顯著緩解仔豬腹瀉,顯著提高母豬及仔豬免疫力??梢?jiàn),枯草芽孢桿菌B6具有良好的益生菌開(kāi)發(fā)潛力。

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