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導(dǎo)讀

   目前，在不添加抗生素和促生長劑等有害添加劑條件下，提高畜產(chǎn)品品質(zhì)成為迫切需要解決的問題。液體發(fā)酵飼料的研發(fā)為開辟綠色飼料提供了新的解決思路，作為一種新型飼料，液體發(fā)酵飼料在歐洲已得到廣泛應(yīng)用，在斷奶仔豬上的優(yōu)勢也被大量試驗結(jié)果所證明。

    液體發(fā)酵飼料作為一種無抗飼料，在保留了固態(tài)飼料物理性質(zhì)上優(yōu)點的同時，具有使用安全、適口性好和動物喜采食等優(yōu)點，可避免了仔豬挑食，還可提高仔豬采食量和生長性能，降低胃腸道pH值和大腸桿菌數(shù)量。另外，優(yōu)質(zhì)液態(tài)發(fā)酵飼料的pH應(yīng)低于4.5，植物乳桿菌活菌數(shù)高于109CFU/mL，乳酸濃度高于150mmol/mL。高濃度的乳酸可降低飼料pH，有利于提高飼料適口性，抑制病原菌增殖。乳酸濃度高于7mmol/mL時，可抑制沙門菌增殖；乳酸濃度高于100mmol/mL時，可抑制大腸桿菌增殖。

    本試驗液體飼料發(fā)酵用的植物乳桿菌是腸道常在菌，它可以減少賴氨酸的生物降解，提高飼料價值；改變腸道內(nèi)環(huán)境，抑制有害菌繁殖；調(diào)整胃腸道菌群平衡，增強畜禽的免疫抗病能力；可提高畜禽的生長速度、奶肉蛋產(chǎn)量和飼料轉(zhuǎn)化利用率。因此植物乳桿菌可廣泛應(yīng)用于動物飼喂、動物飼料和青貯飼料中，對畜牧業(yè)的生產(chǎn)有著重要意義。另外，菌種的好壞會直接影響液體發(fā)酵飼料的發(fā)酵效果和飼喂效果。有研究表明，酵母菌發(fā)酵會導(dǎo)致日糧的適口性降低，影響畜禽的采食量；原料中可能存在其他不適于發(fā)酵的菌種或者其含量太低不足以抑制有害菌的滋生。近年來，研究人員致力于研究自然存在的植物乳桿菌是否適合進行液體發(fā)酵飼料的有益微生物，在發(fā)酵系統(tǒng)中接種特定的有益菌是否會更好。因此，開發(fā)一種適宜的菌種，是液體發(fā)酵飼料的關(guān)鍵技術(shù)之一。

    紫外線照射用于工業(yè)微生物菌種的誘變處理具有悠久的歷史，紫外輻照設(shè)備簡單、效果明顯，是微生物菌種選育的首選誘變因子。誘變育種是指有意識地將生物體暴露于物理的、化學(xué)的或生物的或多種誘變因子中，促使生物體發(fā)生突變，進而從突變體中篩選具有優(yōu)良性狀的突變株的過程。遲乃玉等利用紫外線（UV），硫酸二乙酯（DES），亞硝基胍（NTG）復(fù)合誘變，篩選出一株超氧化物歧化酶（SOD）產(chǎn)量較高的乳酸菌菌株，但對植物乳桿菌進行誘變篩選高產(chǎn)乳酸菌株的相關(guān)研究并未見報道。通過篩選、馴化及生長促進因子的選擇來提高乳桿菌的產(chǎn)乳酸能力為一種行之有效的方法。對植物乳桿菌進行液體發(fā)酵，應(yīng)精選產(chǎn)乳酸能力強、發(fā)酵速度快等性能指標(biāo)優(yōu)良的菌株。優(yōu)良菌株的篩選和利用已經(jīng)成為液體發(fā)酵前必須進行的一項基礎(chǔ)性工作，菌種的質(zhì)量直接影響著液體飼料發(fā)酵的效果及最終發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量。本研究對植物乳桿菌的細胞菌懸液進行紫外照射，選育具有良好發(fā)酵性能的液體發(fā)酵飼料專用乳酸菌，為液體發(fā)酵飼料的研制提供理論依據(jù)。

1.1 出發(fā)菌株

      植物乳桿菌1.1856（Lactobacillus plantarum）購于中國普通微生物菌種保藏中心（CGMCC）。

1.2 儀器設(shè)備

      智能生化培養(yǎng)箱、恒溫儀、高速冷凍離心機、可見分光光度計、漩渦振蕩器、全溫振蕩器、電熱恒溫培養(yǎng)箱、座式自動電熱壓力蒸汽滅菌器、凈化工作臺、可見分光光度計、冰箱及生物實驗室常用設(shè)備等。

1.3 培養(yǎng)基及試劑

        斜面及平板培養(yǎng)基：MRS肉湯培養(yǎng)基（購于索萊寶）加瓊脂和蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至6.2±0.2。

初篩培養(yǎng)基：MRS肉湯培養(yǎng)基加碳酸鈣、瓊脂和蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至6.2±0.2。

種子培養(yǎng)基：MRS肉湯培養(yǎng)基加蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至6.2±0.2。

發(fā)酵全價料培養(yǎng)基：基礎(chǔ)日糧配方見表1。

乳酸測試盒：購于南京建成生物工程研究所。

2.1 菌種活化

    取植物乳桿菌安瓿管，在超凈臺中用酒精脫脂棉對安瓿管外表面進行消毒后，用火焰加熱其頂端，滴少量無菌水至加熱的安瓿頂端使之破裂。將已經(jīng)破裂的安瓿頂端敲下，取0.3 mL液體培養(yǎng)基滴入管內(nèi)，輕輕震蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀. 吸取全部菌懸液，移植于斜面中，37 ℃培養(yǎng)24 h，并連續(xù)兩次繼代培養(yǎng)。

2.2 選育種子液的制備

    將已活化好的植物乳桿菌斜面挑取一環(huán)接種到液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，然后從培養(yǎng)的菌液中取5%菌種，轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，制成選育種子液。

2.3 生長規(guī)律曲線的測定

    從上述培養(yǎng)的選育種子液中取5%菌種轉(zhuǎn)接到液體飼料中（V 水∶V 料=2.5∶1）進行培養(yǎng)試驗，以未接種的液體飼料作空白，采用比濁法測定，在波長600 nm條件下，分別測定該菌種在培養(yǎng)0、6、12、18、24、30、36、42、48 h后的吸光度值. 以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，作植物乳桿菌的生長曲線。

2.4 菌株的紫外誘變

    取菌體斜面，在無菌條件下，加入無菌水5 mL，刮下表面培養(yǎng)物制成懸液，5000 r/min離心5 min，再用生理鹽水洗滌、離心2次. 用10倍稀釋法將菌懸液細胞稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7不同濃度，再各取5 mL置于直徑為9 cm的無菌平皿，內(nèi)置一個消毒轉(zhuǎn)子，將盛有制備好的菌懸液的培養(yǎng)皿放在磁力攪拌器上，放置在紫外誘變箱中，利用15 W紫外燈，照射距離25 cm，設(shè)置照射時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3 min6個梯度處理. 紫外照射后開啟紅光，分別吸取紫外照射的菌懸液0.1 mL涂布于MRS培養(yǎng)基上，每個稀釋度涂3個平板. 以同樣的操作方法，將未經(jīng)紫外線處理的菌液稀釋涂布于MRS培養(yǎng)基上作為對照. 將上述涂勻的平板，用黑布裹好，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24 h. 將培養(yǎng)好的平板取出進行計數(shù)，找出最佳照射劑量，致死率計算公式為：

致死率（%）=（紫外照射前菌液中活菌數(shù)-紫外照射后菌液中活菌數(shù)）/紫外照射前菌液中活菌數(shù)×100%.

2.5 篩選方法

2.5.1 MRS-CaCO₃初篩

    通過植物乳桿菌產(chǎn)生的乳酸溶解培養(yǎng)基中的碳酸鈣形成溶鈣圈大小，判定植物乳桿菌產(chǎn)乳酸能力的大小。

2.5.2 復(fù)篩

    選取初篩產(chǎn)乳酸能力相對較高的幾株菌株，接種到液體發(fā)酵飼料中進行37 ℃振蕩培養(yǎng)，測定產(chǎn)生乳酸情況，篩選出產(chǎn)乳酸能力最大的菌株作為目標(biāo)菌株。

2.6 菌株的穩(wěn)定性試驗

     將誘變菌株連續(xù)傳代發(fā)酵，每次傳代都要進行乳酸的測定，觀察誘變菌株產(chǎn)乳酸的穩(wěn)定性。

2.7 乳酸的測定

     采用乳酸測試盒。