液體發(fā)酵飼料植物乳桿菌誘變育種的研究
導(dǎo)讀
目前，在不添加抗生素和促生長(zhǎng)劑等有害添加劑條件下，提高畜產(chǎn)品品質(zhì)成為迫切需要解決的問(wèn)題。液體發(fā)酵飼料的研發(fā)為開(kāi)辟綠色飼料提供了新的解決思路，作為一種新型飼料，液體發(fā)酵飼料在歐洲已得到廣泛應(yīng)用，在斷奶仔豬上的優(yōu)勢(shì)也被大量試驗(yàn)結(jié)果所證明。
液體發(fā)酵飼料作為一種無(wú)抗飼料，在保留了固態(tài)飼料物理性質(zhì)上優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，具有使用安全、適口性好和動(dòng)物喜采食等優(yōu)點(diǎn)，可避免了仔豬挑食，還可提高仔豬采食量和生長(zhǎng)性能，降低胃腸道pH值和大腸桿菌數(shù)量。另外，優(yōu)質(zhì)液態(tài)發(fā)酵飼料的pH應(yīng)低于4.5，植物乳桿菌活菌數(shù)高于109CFU/mL，乳酸濃度高于150mmol/mL。高濃度的乳酸可降低飼料pH，有利于提高飼料適口性，抑制病原菌增殖。乳酸濃度高于7mmol/mL時(shí)，可抑制沙門菌增殖；乳酸濃度高于100mmol/mL時(shí)，可抑制大腸桿菌增殖。
本試驗(yàn)液體飼料發(fā)酵用的植物乳桿菌是腸道常在菌，它可以減少賴氨酸的生物降解，提高飼料價(jià)值；改變腸道內(nèi)環(huán)境，抑制有害菌繁殖；調(diào)整胃腸道菌群平衡，增強(qiáng)畜禽的免疫抗病能力；可提高畜禽的生長(zhǎng)速度、奶肉蛋產(chǎn)量和飼料轉(zhuǎn)化利用率。因此植物乳桿菌可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物飼喂、動(dòng)物飼料和青貯飼料中，對(duì)畜牧業(yè)的生產(chǎn)有著重要意義。另外，菌種的好壞會(huì)直接影響液體發(fā)酵飼料的發(fā)酵效果和飼喂效果。有研究表明，酵母菌發(fā)酵會(huì)導(dǎo)致日糧的適口性降低，影響畜禽的采食量；原料中可能存在其他不適于發(fā)酵的菌種或者其含量太低不足以抑制有害菌的滋生。近年來(lái)，研究人員致力于研究自然存在的植物乳桿菌是否適合進(jìn)行液體發(fā)酵飼料的有益微生物，在發(fā)酵系統(tǒng)中接種特定的有益菌是否會(huì)更好。因此，開(kāi)發(fā)一種適宜的菌種，是液體發(fā)酵飼料的關(guān)鍵技術(shù)之一。
紫外線照射用于工業(yè)微生物菌種的誘變處理具有悠久的歷史，紫外輻照設(shè)備簡(jiǎn)單、效果明顯，是微生物菌種選育的首選誘變因子。誘變育種是指有意識(shí)地將生物體暴露于物理的、化學(xué)的或生物的或多種誘變因子中，促使生物體發(fā)生突變，進(jìn)而從突變體中篩選具有優(yōu)良性狀的突變株的過(guò)程。遲乃玉等利用紫外線（UV），硫酸二乙酯（DES），亞硝基胍（NTG）復(fù)合誘變，篩選出一株超氧化物歧化酶（SOD）產(chǎn)量較高的乳酸菌菌株，但對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行誘變篩選高產(chǎn)乳酸菌株的相關(guān)研究并未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)篩選、馴化及生長(zhǎng)促進(jìn)因子的選擇來(lái)提高乳桿菌的產(chǎn)乳酸能力為一種行之有效的方法。對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行液體發(fā)酵，應(yīng)精選產(chǎn)乳酸能力強(qiáng)、發(fā)酵速度快等性能指標(biāo)優(yōu)良的菌株。優(yōu)良菌株的篩選和利用已經(jīng)成為液體發(fā)酵前必須進(jìn)行的一項(xiàng)基礎(chǔ)性工作，菌種的質(zhì)量直接影響著液體飼料發(fā)酵的效果及最終發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量。本研究對(duì)植物乳桿菌的細(xì)胞菌懸液進(jìn)行紫外照射，選育具有良好發(fā)酵性能的液體發(fā)酵飼料專用乳酸菌，為液體發(fā)酵飼料的研制提供理論依據(jù)。
1試驗(yàn)材料
1.1 出發(fā)菌株
植物乳桿菌1.1856（Lactobacillus plantarum）購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心（CGMCC）。
1.2 儀器設(shè)備
智能生化培養(yǎng)箱、恒溫儀、高速冷凍離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、漩渦振蕩器、全溫振蕩器、電熱恒溫培養(yǎng)箱、座式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器、凈化工作臺(tái)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、冰箱及生物實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備等。
1.3 培養(yǎng)基及試劑
斜面及平板培養(yǎng)基：MRS肉湯培養(yǎng)基（購(gòu)于索萊寶）加瓊脂和蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至6.2±0.2。
初篩培養(yǎng)基：MRS肉湯培養(yǎng)基加碳酸鈣、瓊脂和蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至6.2±0.2。
種子培養(yǎng)基：MRS肉湯培養(yǎng)基加蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至6.2±0.2。
發(fā)酵全價(jià)料培養(yǎng)基：基礎(chǔ)日糧配方見(jiàn)表1。
乳酸測(cè)試盒：購(gòu)于南京建成生物工程研究所。
試驗(yàn)方法
2.1 菌種活化
取植物乳桿菌安瓿管，在超凈臺(tái)中用酒精脫脂棉對(duì)安瓿管外表面進(jìn)行消毒后，用火焰加熱其頂端，滴少量無(wú)菌水至加熱的安瓿頂端使之破裂。將已經(jīng)破裂的安瓿頂端敲下，取0.3 mL液體培養(yǎng)基滴入管內(nèi)，輕輕震蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀. 吸取全部菌懸液，移植于斜面中，37 ℃培養(yǎng)24 h，并連續(xù)兩次繼代培養(yǎng)。
2.2 選育種子液的制備
將已活化好的植物乳桿菌斜面挑取一環(huán)接種到液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，然后從培養(yǎng)的菌液中取5%菌種，轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，制成選育種子液。
2.3 生長(zhǎng)規(guī)律曲線的測(cè)定
從上述培養(yǎng)的選育種子液中取5%菌種轉(zhuǎn)接到液體飼料中（V 水∶V 料=2.5∶1）進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)，以未接種的液體飼料作空白，采用比濁法測(cè)定，在波長(zhǎng)600 nm條件下，分別測(cè)定該菌種在培養(yǎng)0、6、12、18、24、30、36、42、48 h后的吸光度值. 以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，作植物乳桿菌的生長(zhǎng)曲線。
2.4 菌株的紫外誘變
取菌體斜面，在無(wú)菌條件下，加入無(wú)菌水5 mL，刮下表面培養(yǎng)物制成懸液，5000 r/min離心5 min，再用生理鹽水洗滌、離心2次. 用10倍稀釋法將菌懸液細(xì)胞稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7不同濃度，再各取5 mL置于直徑為9 cm的無(wú)菌平皿，內(nèi)置一個(gè)消毒轉(zhuǎn)子，將盛有制備好的菌懸液的培養(yǎng)皿放在磁力攪拌器上，放置在紫外誘變箱中，利用15 W紫外燈，照射距離25 cm，設(shè)置照射時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3 min6個(gè)梯度處理. 紫外照射后開(kāi)啟紅光，分別吸取紫外照射的菌懸液0.1 mL涂布于MRS培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度涂3個(gè)平板. 以同樣的操作方法，將未經(jīng)紫外線處理的菌液稀釋涂布于MRS培養(yǎng)基上作為對(duì)照. 將上述涂勻的平板，用黑布裹好，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24 h. 將培養(yǎng)好的平板取出進(jìn)行計(jì)數(shù)，找出最佳照射劑量，致死率計(jì)算公式為：
致死率（%）=（紫外照射前菌液中活菌數(shù)-紫外照射后菌液中活菌數(shù)）/紫外照射前菌液中活菌數(shù)×100%.
2.5 篩選方法
2.5.1 MRS-CaCO3初篩
通過(guò)植物乳桿菌產(chǎn)生的乳酸溶解培養(yǎng)基中的碳酸鈣形成溶鈣圈大小，判定植物乳桿菌產(chǎn)乳酸能力的大小。
2.5.2 復(fù)篩
選取初篩產(chǎn)乳酸能力相對(duì)較高的幾株菌株，接種到液體發(fā)酵飼料中進(jìn)行37 ℃振蕩培養(yǎng)，測(cè)定產(chǎn)生乳酸情況，篩選出產(chǎn)乳酸能力最大的菌株作為目標(biāo)菌株。
2.6 菌株的穩(wěn)定性試驗(yàn)
將誘變菌株連續(xù)傳代發(fā)酵，每次傳代都要進(jìn)行乳酸的測(cè)定，觀察誘變菌株產(chǎn)乳酸的穩(wěn)定性。
2.7 乳酸的測(cè)定
采用乳酸測(cè)試盒。
3結(jié)果與分析
3.1 植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線
在菌種的誘變育種中，選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生理狀態(tài)的菌體具有很重要的意義。 處于對(duì)數(shù)期的植物乳桿菌，其個(gè)體形態(tài)和生理特性等均較一致，并且生長(zhǎng)旺盛、代謝活性強(qiáng)，細(xì)胞繁殖快，生命力強(qiáng)，重復(fù)性能較好，易引起變異。 同時(shí)為了保證處理時(shí)具有一定的細(xì)胞濃度，以增加可能變異的細(xì)胞總數(shù)，常選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期的細(xì)胞進(jìn)行處理。 從圖1可以看出，該菌在培養(yǎng)至6~24 h時(shí)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，之后開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。 所以選擇12~24 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液進(jìn)行誘變選育。
3.2 紫外照射劑量的確定
利用紫外線照射誘變稀釋度為10-3 個(gè)/mL的植物乳桿菌細(xì)胞菌懸液，平板涂布培養(yǎng)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。不同的紫外線照射時(shí)間會(huì)造成不同的致死率，其致死率曲線關(guān)系見(jiàn)圖2。從圖2可看出，隨著紫外線照射時(shí)間的延長(zhǎng)，植物乳桿菌的致死率逐漸增大，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，較高的致死率有利于篩選優(yōu)良菌株；如果處理時(shí)間太長(zhǎng)，一些高活性菌株也有可能致死，反而不利于篩選。 根據(jù)近年來(lái)對(duì)紫外線等多種誘變劑誘變效應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)，正向突變較多地出現(xiàn)在偏低劑量中。 對(duì)于經(jīng)多次誘變的菌株，在較低的誘變劑量時(shí)有利于正向突變，較多地出現(xiàn)在70%~80%致死率中。 設(shè)定以80%致死率時(shí)的照射時(shí)間作為最佳照射時(shí)間進(jìn)行誘變。 從圖2中可以看出，當(dāng)照射時(shí)間為2 min時(shí)致死率可達(dá)到82%，由此判定此時(shí)為最佳誘變時(shí)間，以后的試驗(yàn)中誘變時(shí)間均選擇2 min。
3.3 MRS-CaCO3初篩結(jié)果
出發(fā)菌株的菌懸液經(jīng)紫外誘變后稀釋涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后從MRS培養(yǎng)基上共分離得到79株長(zhǎng)勢(shì)較好的白色單菌落，再根據(jù)MRS-CaCO3初篩培養(yǎng)基的溶鈣圈大小對(duì)此79株菌進(jìn)行了初步篩選，從中篩選出10株正突變菌株，結(jié)果如圖3所示，兩個(gè)平板的中心都是原始菌株的菌落，原始菌種的周邊都是正突變菌種，其中左邊平板中有6株正突變菌種，右邊平板中有4株正突變菌種。
3.4 乳酸測(cè)定復(fù)篩結(jié)果
首先將初步篩選的10株菌分別接種于MRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，分別接入三角瓶中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，再按5%接種量將入選菌接入到液體發(fā)酵飼料中（配方見(jiàn)表1），37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定乳酸含量。 結(jié)果如表2。
3.5 突變菌株穩(wěn)定性測(cè)定
將UR-3突變菌株連續(xù)傳代5次，每傳一代分別進(jìn)行液體發(fā)酵試驗(yàn)，從而測(cè)定發(fā)酵液中菌株的產(chǎn)乳酸含量，結(jié)果見(jiàn)表3。
上述各代的產(chǎn)乳酸能力差異不顯著（p>0.05），基本一致變化不大，這充分說(shuō)明了該誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性好，不容易發(fā)生退變。
討論與結(jié)論
液體發(fā)酵飼料的發(fā)酵控制是一項(xiàng)極為關(guān)鍵的技術(shù)，特別是菌種的好壞，直接影響液體發(fā)酵飼料的飼喂效果。 為提高原始菌株的產(chǎn)乳酸能力，本研究選擇了常規(guī)紫外線做誘變因子進(jìn)行誘變。 用于誘變育種的誘變因素有物理因素和化學(xué)因素。 在物理誘變因素中，紫外線比較有效、適用、安全，其他幾種射線都是電離性質(zhì)的，具有穿透力，使用時(shí)有一定的危險(xiǎn)性；化學(xué)誘變劑的突變率通常要比電離輻射高，并且十分經(jīng)濟(jì)，但這些物質(zhì)大多是致癌劑，使用時(shí)必須十分謹(jǐn)慎。 試驗(yàn)中，在紫外燈功率和照射距離一定的情況下，通過(guò)改變紫外照射時(shí)間來(lái)獲得不同的誘變劑量，把正變率最高的照射時(shí)間確定為最佳誘變劑量，本試驗(yàn)最終成功選育出一株高產(chǎn)乳酸的突變菌株UR-3，經(jīng)5次傳代后，其乳酸高產(chǎn)性狀保持穩(wěn)定。
在本研究中，菌種誘變處理完后，在分離、篩選正突變菌株的環(huán)節(jié)中，針對(duì)性地選擇MRS培養(yǎng)基作為誘變后的富集培養(yǎng)基，從中篩選出長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株作為初篩對(duì)象，大大減少了工作量。 種子液接種量直接影響菌株發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量，因此在正突變株復(fù)篩的發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)嚴(yán)格控制各菌株發(fā)酵液中種子液接種量，確保各菌株發(fā)酵液的種子液接種量一致。
綜上所述，通過(guò)紫外誘變植物乳桿菌的篩選方法，選育出高產(chǎn)乳酸的植物乳桿菌突變菌株UR-3，顯著地提高了產(chǎn)乳酸量（p<0.05），該菌株的遺傳穩(wěn)定性良好，有助于后期培育。 在液體發(fā)酵飼料中，經(jīng)紫外誘變后該菌株產(chǎn)乳酸的能力較出發(fā)菌株提高了44.53%，為后續(xù)的液體發(fā)酵飼料的研制提供了新的研究思路和方向。
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