1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

濃醬兼香型酒醅樣品：采自湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司釀酒車間（第三輪次、第四輪次、第五輪次和第六輪次），各輪次的入池和出池酒醅樣品采集數(shù)量均為2份，各酒醅樣品pH值在3.2～4.5之間。

1.1.2 化學(xué)試劑

溶菌酶（20000U/mg）：蓋云天（武漢）生物技術(shù)有限公司；Ezup柱式細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒、聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物：生工生物工程（上海）股份有限公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate，dNTP）、DNA聚合酶（5U/μL）：寶生物工程（大連）有限公司；蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏（均為生化試劑）：安琪酵母有限公司；葡萄糖、吐溫80、磷酸氫二鉀、無水乙酸鈉、乙酸、檸檬酸氫二銨、七水硫酸鎂、一水硫酸錳（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙酸乙酯、正丙醇、叔戊醇（均為色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：牛肉膏10g、蛋白胨10g、酵母浸粉5g、葡萄糖5g、無水乙酸鈉5g、磷酸氫二鉀2g、檸檬酸氫二銨2g、吐溫-801mL、七水硫酸鎂0.2g、一水硫酸錳0.05g、蒸餾水1000mL，pH值調(diào)至6.5～6.8，分裝滅菌，115℃高壓滅菌30min。

MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉20g，115℃高壓滅菌30min。

改良MRS固體培養(yǎng)基：在MRS固體培養(yǎng)基中添加1.5%的CaCO3。

酸度耐受性培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，使用乙酸-乳酸（1∶1，V/V）混合酸調(diào)整其pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.5。

乙醇耐受性培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，按體積分數(shù)分別加入2%、4%、6%、8%、10%的無水乙醇。

1.2 儀器與設(shè)備

ECLIPSE80i相差顯微鏡：日本Nikon公司；ZHJH-C1115B超凈工作臺、ZXDP-A2160全自動新型電熱培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；T3000PCR儀：德國Biometra公司；SYDR/1305凝膠成像儀：美國Syngene公司；UV-5900PC紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；YXQ-LS-50Sll立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；7890A氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、1260c高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 濃醬兼香型酒醅乳酸菌的分離

稱取不同輪次酒醅樣品10g，加入90mL無菌水中，30℃、170r/min搖床振蕩0.5h，經(jīng)系列稀釋后，取適當稀釋度的菌液各1mL涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，封口，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱72h靜置培養(yǎng)。待乳酸菌長出后，隨機挑取形態(tài)不同的單菌落，在改良MRS固體培養(yǎng)基上劃線分離純化2～3次，挑取產(chǎn)生透明圈的單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)48h，進行革蘭氏染色和過硫化氫實驗，將革蘭氏染色呈陽性且過硫化氫實驗呈陰性的菌株初步確定為乳酸菌。分離乳酸菌時MRS培養(yǎng)基中均添加100U/mL制霉菌素，以抑制酒醅中酵母菌的生長。

1.3.2 濃醬兼香型酒醅乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定

挑取純化后的乳酸菌單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30℃、靜置培養(yǎng)48h，用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，完成后置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。以分離菌株的基因組DNA為模板，采用乳酸菌16SrDNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）與1492R（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對其16S rDNA進行PCR擴增。PCR擴增體系：2×Power Taq MaserMix 25μL，DNA模板1μL，引物27F和1492R各1μL，雙蒸水（ddH2O）22μL。PCR擴增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性50s，54℃退火50s，72℃延伸90s，30個循環(huán)；72℃再延伸10min。取5μLPCR擴增產(chǎn)物，利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。取1400bp左右的16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。采DNAStar軟件對測序結(jié)果進行人工校對。校正以后的序列提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源序列搜索，比較測試菌株和已知乳酸菌菌株之間的親緣關(guān)系及其系統(tǒng)地位。根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，用DNAMAN6.0校準排齊序列，采用MEGA5.2軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法，1000次Bootstrap檢驗構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 不同輪次布氏乳桿菌生長特性的測定

耐酸能力的測定：挑取布氏乳桿菌單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基，裝液量20mL/25mL，30℃靜置培養(yǎng)48h，進行活化。按1%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，裝液量20mL/25mL，30℃靜置培養(yǎng)24h，作為種子液。將種子液按1%（V/V）的接種量分別接種到不同pH值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.5）的MRS液體培養(yǎng)基中，裝液量20mL/25mL，30℃靜置培養(yǎng)48h，將菌液稀釋一定倍數(shù)，采用紫外分光光度計測菌液的OD600nm值。

耐乙醇能力的測定：將布氏乳桿菌種子液按1%（V/V）的接種量分別接種于含不同乙醇體積分數(shù)（0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%）的MRS液體培養(yǎng)基中，裝液量20mL/25mL，30℃靜置培養(yǎng)48h，將菌液稀釋一定倍數(shù)，采用紫外分光光度計測菌液的OD600nm值。

耐高溫能力的測定：將布氏乳桿菌種子液按1%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，裝液量20mL/25mL，分別在37℃、41℃、45℃、50℃條件下，靜置培養(yǎng)48h，將菌液稀釋一定倍數(shù)，采用紫外分光光度計測菌液的OD600nm值。

1.3.4 不同布氏乳桿菌株液體發(fā)酵實驗

將布氏乳桿菌種子液按2%（V/V）的接種量接種于200mL MRS液體培養(yǎng)基，搖勻，用無菌不透氣保鮮膜封口，密閉，28℃恒溫靜置發(fā)酵3d。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液過膜處理，采用高效液相色譜分析發(fā)酵產(chǎn)物差異。

1.3.5 發(fā)酵產(chǎn)物中有機酸的測定

取布氏乳桿菌發(fā)酵液，渦旋振蕩混勻，直接用5mL的注射器（不帶針頭）取不同菌株發(fā)酵液5mL，先用0.45μm有機濾膜初步過濾，再用0.22μm有機濾膜注入2mL的液相進樣瓶中，每一個處理條件平行三次。采用高效液相色譜法檢測有機酸，HPLC條件：Bio-RadAminexHPX-87H色譜柱（300mm×7.8mm×9μm），柱溫30℃，檢測器二極管陣列紫外-可見光檢測器，檢測波長210nm，流速0.6mL/min，進樣量10μL，流動相為4mmol/L硫酸溶液。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

通過SPSS22.0軟件分析不同樣本間是否存在顯著性差異，對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，使用Tukey方法，假設(shè)樣本間方差相等，若Tukey HSD檢驗P＞0.05則無顯著性差異；0.01＜P＜0.05則差異顯著；P＜0.01則差異極顯著。

2結(jié)果與分析

本研究從濃醬兼香型不同輪次的酒醅中共分離到30株乳酸菌，歸屬于3個屬共5個種，分別為布氏乳桿菌、植物乳桿菌、糞腸球菌、乳酸片球菌和戊糖片球菌，其中布氏乳桿菌（L.buchneri）最多，為21株，占總分離菌株數(shù)的70%，是第三、第四輪出池酒醅中的優(yōu)勢乳酸菌。

不同輪次酒醅中分離的19株L.buchneri的耐酸、耐乙醇和耐高溫生長能力存在一定差異，最適生長pH值大多在4.5左右，其中，菌株ZS-B3、ZS-B9和ZS-B10耐酸性較好，pH4.0條件下培養(yǎng)48h后，OD600nm值可以達到0.2；對乙醇的耐受能力在2%～10%之間，約有50%的菌株乙醇耐受能力達到6%，其中菌株ZS-B18和ZS-B16乙醇耐受能力最強，在含10%乙醇的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后，OD600nm值仍能達到0.7；最適生長溫度均為37℃，在41℃條件下，L.buchneri生長均受到抑制，當溫度升高到45℃時，所有菌株均停止生長。

6株布氏乳桿菌代表菌株表現(xiàn)出了較強的發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸和乙酸的能力。其平均檸檬酸產(chǎn)量為3.761g/L，平均乙酸產(chǎn)量為4.222g/L，分別是L. plantarum ZR1的11.13倍和1.80倍。檸檬酸是良好的食物酸味劑，具有抗氧化、增加酸味、抑制細菌等作用。傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵白酒中主要呈香物質(zhì)乙酸乙酯的形成又與乙酸有直接相關(guān)。對布氏乳桿菌在白酒發(fā)酵系統(tǒng)中的存在狀態(tài)及其功能進行研究，對于調(diào)控白酒中檸檬酸和乙酸乙酯含量具有一定的指導(dǎo)意義。