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復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵改善甘薯渣營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的研究

2019-04-24 17:51:43      點(diǎn)擊:

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導(dǎo)讀

我國(guó)是甘薯生產(chǎn)大國(guó),種植面積大,總產(chǎn)量高,分別占到全世界的70%和85%左右,年產(chǎn)量高達(dá)1.2億t。甘薯渣是甘薯加工中提取淀粉后的副產(chǎn)品,每年我國(guó)都有大量的甘薯渣產(chǎn)生,有資料顯示,一個(gè)甘薯淀粉生產(chǎn)加工企業(yè),每年產(chǎn)淀粉3000t,那么每年將會(huì)產(chǎn)生甘薯渣4000t以上。甘薯渣纖維素含量高,蛋白質(zhì)含量低,同時(shí)水分含量很高,不易儲(chǔ)存,并且極易受微生物污染而腐敗變質(zhì),因此限制了其利用,通常是直接作為農(nóng)家飼料加以簡(jiǎn)單利用或被當(dāng)作廢棄物丟棄。隨著我國(guó)飼料資源的日益匱乏,人們開(kāi)始關(guān)注甘薯渣的開(kāi)發(fā)利用,以農(nóng)副產(chǎn)品廢棄物為原料,利用微生物固態(tài)發(fā)酵(solid-state fermentation,SSF)生產(chǎn)生物飼料逐漸受到人們的重視。目前我國(guó)對(duì)甘薯渣開(kāi)發(fā)利用較多的是利用其發(fā)酵生產(chǎn)酒精、膳食纖維、果膠、檸檬酸、多聚γ-谷氨酸等。國(guó)外對(duì)甘薯渣的應(yīng)用主要是用于生產(chǎn)不飽和脂肪酸以及用單菌或混菌固態(tài)發(fā)酵甘薯渣富集蛋白質(zhì)等。有關(guān)甘薯渣固態(tài)發(fā)酵開(kāi)發(fā)新飼料資源的研究報(bào)道較少,若通過(guò)菌種的篩選及復(fù)配,探討甘薯渣的最佳發(fā)酵工藝參數(shù),可望有效提高甘薯渣營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,開(kāi)拓新的飼料資源。在此本研究擬以曲霉類(lèi)、木霉類(lèi)、芽孢桿菌類(lèi)、酵母類(lèi)4類(lèi)共12種菌株對(duì)甘薯渣進(jìn)行單菌發(fā)酵,從中篩選1株發(fā)酵效果好的菌株作為混菌發(fā)酵的主菌種,與其他3類(lèi)篩選出的菌株進(jìn)行復(fù)配,篩選最佳菌種組合,采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、料水比、接種量及菌種復(fù)配比例等條件進(jìn)行優(yōu)化,篩選出適合甘薯渣發(fā)酵的工藝參數(shù)。研究結(jié)果可望為甘薯渣等低品質(zhì)的非常規(guī)飼料原料的開(kāi)發(fā)與利用提供有益參考。

1材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

發(fā)酵菌種:本試驗(yàn)所用菌種均為購(gòu)買(mǎi)或獲贈(zèng)于其他實(shí)驗(yàn)室,共12株,包含曲霉菌3株,木霉菌2株,枯草芽孢桿菌4 株,酵母菌3 株。菌種保存在4 ℃冰箱,每3 個(gè)月活化1 次。

發(fā)酵培養(yǎng)基:甘薯渣和菜籽粕按9∶ 1 混勻,30 g裝入250 mL 廣口瓶,121℃滅菌20 min。甘薯渣購(gòu)于綿陽(yáng)一淀粉加工廠,為提取淀粉后的殘?jiān)?,粗蛋白質(zhì)含量為1.76% ,粗纖維含量為8.80% ;菜籽粕購(gòu)于四川省雅安市農(nóng)牧市場(chǎng),粗蛋白質(zhì)含量為36.93% ,粗纖維含量為12. 27%。


1.2 最適單菌種的篩選及菌種復(fù)配篩選

采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì),4 類(lèi)共12 株菌種分別接種于甘薯渣發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行單菌發(fā)酵。發(fā)酵條件為接種量1 × 106 個(gè)/g,加水60% ,溫度30 ℃,發(fā)酵4d,pH 自然,每株菌重復(fù)3 次,以未添加菌液的空白發(fā)酵組為對(duì)照??疾彀l(fā)酵前后粗蛋白質(zhì)含量、羧甲基纖維素酶( carboxymethyl cellulose,CMCase) 活性和還原糖含量變化,從曲霉類(lèi)、木霉類(lèi)、芽孢桿菌類(lèi)、酵母類(lèi)菌株中,各篩選1 株最適發(fā)酵菌種,并以篩選出的4 株菌中發(fā)酵效果最好的菌種作為主菌種(A) ,分別和其他的3 株輔發(fā)酵菌種(B、C、D) 進(jìn)行雙菌、三菌和四菌混菌復(fù)配篩選。各菌種的接種比例為1∶ 1 (1∶ 1∶ 1、1∶ 1∶ 1∶1) ,每組均設(shè)3 個(gè)重復(fù)。發(fā)酵條件參考主發(fā)酵菌單因素發(fā)酵優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果:接種量1 × 106 個(gè)/g,發(fā)酵時(shí)間4 d,料水比(m/V) 1∶ 1. 3,培養(yǎng)溫度38 ℃。最終以粗蛋白質(zhì)含量為主要指標(biāo),CMCase 活性和還原糖為輔助指標(biāo),確定最優(yōu)的菌種組合。


1.3 正交試驗(yàn)優(yōu)發(fā)混菌發(fā)酵條件

采用正交設(shè)計(jì)進(jìn)一步對(duì)發(fā)酵溫度( A)、發(fā)酵時(shí)間(B)、料水比(C)、接種量(D)、菌種復(fù)配比例(E) 進(jìn)行5 因素4 水平的發(fā)酵條件優(yōu)化( n = 3)。其中接種量、發(fā)酵時(shí)間、料水比、發(fā)酵溫度水平設(shè)置參考主發(fā)酵菌單因素發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果。發(fā)酵結(jié)束后,取部分鮮樣測(cè)定CMCase 活性,剩余部分65 ℃烘干,粉碎過(guò)40 目篩,用于測(cè)定粗蛋白質(zhì)和還原糖含量。


1.4 最優(yōu)發(fā)酵條件發(fā)酵對(duì)甘薯渣營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響

根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化出的混菌發(fā)酵參數(shù),對(duì)甘薯渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,設(shè)置1 個(gè)對(duì)照組( 不接種菌種),其他條件與試驗(yàn)組一致。每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束后,取部分鮮樣測(cè)定CMCase、濾紙酶( filterpaper,F(xiàn)PA)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)、淀粉酶活性,剩余部分65 ℃烘干,粉碎過(guò)40 目篩,用于測(cè)定干物質(zhì)、粗灰分、粗纖維、粗脂肪、粗蛋白質(zhì)、還原糖含量。


1.5 指標(biāo)測(cè)定

還原糖含量測(cè)定參照黃曉鈺等《食品化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)》;水分、粗脂肪、粗蛋白質(zhì)、粗灰分、粗纖維含量的測(cè)定參照張麗英《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》; 纖維素酶活性參照國(guó)標(biāo)GB /T23881—2009、何鳳琴等及湯小朋等的測(cè)定方法;淀粉酶活性參照陳毓荃主編的《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)》中介紹的淀粉酶活性的測(cè)定方法。


1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)先用Excel 2003 進(jìn)行整理,再用SPSS21. 0 處理、分析。單因素篩選試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析并結(jié)合Duncan 氏法進(jìn)行多重比較;正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析及方差分析。所有試驗(yàn)結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,顯著水平為P <0.05。

2結(jié)果與分析

2.1 最適單菌種發(fā)酵的篩選

12 種單菌種發(fā)酵甘薯渣后,粗蛋白質(zhì)含量、CMCase 活性、還原糖含量見(jiàn)表1。從表中可以看出,黑曲霉2 發(fā)酵甘薯渣后其粗蛋白質(zhì)含量從5.64%提高到7.89% ,提高了44.7% ,顯著高于其他菌種發(fā)酵組(P<0.05) ;黑曲霉2發(fā)酵組所產(chǎn)的CMCase 活性為2.61 U /g,顯著高于其他單菌發(fā)酵組(P<0.05)。綜合考慮粗蛋白質(zhì)含量、CMCase活性和還原糖含量等指標(biāo),確定黑曲霉2為曲霉組中優(yōu)勢(shì)菌種,同時(shí)也是12種菌株中最優(yōu)發(fā)酵菌種,將其定為本試驗(yàn)主發(fā)酵菌種,記作A。

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木霉組中里氏木霉和綠色木霉發(fā)酵甘薯渣后,其粗蛋白質(zhì)含量無(wú)顯著差異(P>0.05),但CMCase 活性高于綠色木霉發(fā)酵組(P<0.05),因此選擇里氏木霉作為木霉組中優(yōu)勢(shì)菌種,記作B。芽孢桿菌組中,枯草芽孢桿菌1組粗蛋白質(zhì)含量顯著高于其他3個(gè)組(P<0.05);枯草芽孢桿菌1和3發(fā)酵后CMCase活性相當(dāng),顯著高于其余2個(gè)芽孢桿菌發(fā)酵組(P<0.05),因此確定枯草芽孢桿菌1作為芽孢桿菌中的優(yōu)勢(shì)菌種,記作C。酵母發(fā)酵組中,釀酒酵母1發(fā)酵后的粗蛋白質(zhì)含量顯著高于其他2個(gè)發(fā)酵組(P<0.05)。選擇釀酒酵母1作為酵母菌中的優(yōu)勢(shì)菌種,記作D。


2.2 最優(yōu)復(fù)配菌種組合篩選

以黑曲霉2為主發(fā)酵菌株(A),與2.1試驗(yàn)篩選出的優(yōu)勢(shì)菌株里氏木霉(B)、枯草芽孢桿菌1(C)和釀酒酵母1(D)分別進(jìn)行1∶1、1∶1∶1和1∶1∶1∶1的復(fù)配,考察不同混菌組合對(duì)甘薯渣發(fā)酵效果的影響,結(jié)果見(jiàn)表2。

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從表2可以看出,混菌組合發(fā)酵與單菌發(fā)酵相比,均提高發(fā)酵后原料粗蛋白質(zhì)含量。粗蛋白質(zhì)含量最高的是ABCD組合,達(dá)到8.39%,其次是ABC組合,2種組合發(fā)酵甘薯渣的粗蛋白質(zhì)含量均顯著高于其他發(fā)酵組合(P<0.05)。同時(shí)ABCD組合CMCase活性顯著高于其他菌種組合(P<0.05),達(dá)到3.04U。還原糖含量除ACD組合最低外(P<0.05),其余的組合之間差異不顯著(P>0.05)。綜合分析,ABCD組合發(fā)酵對(duì)甘薯渣營(yíng)養(yǎng)價(jià)值改善最高,確定該組合為最優(yōu)菌種組合。


2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

采用L16(45)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),考察發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量、料水比、菌種復(fù)配比例對(duì)甘薯渣發(fā)酵的影響。各因素水平為發(fā)酵溫度(32、34、36、38 ℃)、發(fā)酵時(shí)間(3、3. 5、4、4. 5 d)、接種量(2. 5、5、10、20 ×105 CFU /g) ,料水比(1∶ 1. 2、1∶ 1. 3、1∶ 1. 4、1∶ 1. 5) ,菌種復(fù)配比例( 黑曲霉2∶里氏木霉∶ 枯草芽孢桿菌1∶ 釀酒酵母1 = 1∶ 1∶ 1∶ 1、1∶ 1∶ 2∶ 1、1∶ 2∶ 1∶ 1、1∶ 2∶ 2∶ 1) ,分別用A、B、C、D、E表示。由極差分析( 表3 ) 粗蛋白質(zhì)R 值可以看出,RD > RC > RE > RA > RB,即接種量對(duì)發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量影響最大,其次是料水比,然后是菌種復(fù)配比例,再是溫度,最后是發(fā)酵時(shí)間。由粗蛋白質(zhì)K 值可得最佳發(fā)酵組合A4B2C1D3E2。從CMCase R值可以看出,RA >RB >RC >RD >RE,即5 個(gè)參數(shù)對(duì)CMCase活的影響程度有大到小依次是發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、料水比、接種量、菌種復(fù)配比例。由CMCase K 值可得最佳組合為A4B4C1D3E1。綜合粗蛋白質(zhì)和CMCase R值和K值,得出最適發(fā)酵參數(shù)組合是A4B4C1D3E2,即發(fā)酵溫度38℃,培養(yǎng)時(shí)間4.5d,料水比1∶1.2,接種量1×106個(gè)/g,接種比例為1∶1∶2∶1。

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討 論

不同的微生物產(chǎn)酶的種類(lèi)和產(chǎn)酶能力不同,需要根據(jù)發(fā)酵目的不同來(lái)選擇不同的微生物進(jìn)行發(fā)酵。本研究一共對(duì)4類(lèi)共12種菌株進(jìn)行發(fā)酵篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)曲霉中的黑曲霉2,木霉中的里氏木霉,芽孢桿菌枯草芽孢桿菌1,酵母中的釀酒酵母1效果較好。其中黑曲霉能產(chǎn)生淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、葡萄糖酶、植酸酶、半乳甘露聚糖酶等酶類(lèi),因此在發(fā)酵中得到廣泛的應(yīng)用,但黑曲霉因變異性大,不同的黑曲霉菌株,發(fā)酵效果不一樣。木霉也廣泛用于微生物發(fā)酵,資料報(bào)道里氏木霉能分泌大量的纖維素酶和木聚糖酶。芽孢桿菌作為益生菌,可促進(jìn)動(dòng)物對(duì)飼料的消化、吸收、利用,從而提高飼料的轉(zhuǎn)化率,并在防病促生長(zhǎng)中起到非常重要作用。酵母屬于益生菌,在發(fā)酵中應(yīng)用廣泛,發(fā)酵過(guò)程中酵母自身的繁殖生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生大量的高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值菌體蛋白。

以篩選出的黑曲霉2為主發(fā)酵菌,與篩選出的其他3種菌種進(jìn)行不同復(fù)配,發(fā)現(xiàn)四菌組合發(fā)酵效果優(yōu)于雙菌和三菌組合,發(fā)酵后甘薯渣粗蛋白質(zhì)含量和CMCase酶活均高于其他組合(表2)。有研究報(bào)道,里氏木霉與黑曲霉混合發(fā)酵可彌補(bǔ)里氏木霉所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶活性較低的不足,提高酶解效率,讓基質(zhì)充分發(fā)酵。Ahamed等對(duì)里氏木霉RUT-C30與黑曲霉LMA進(jìn)行混合發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)FPA可達(dá)到7.1U/mL,與單菌發(fā)酵的3.4U/mL相比提高了108.8%。本研究發(fā)現(xiàn)4菌混合發(fā)酵,效果優(yōu)于其他發(fā)酵組合,可能原因在于多菌組合發(fā)揮了各個(gè)菌種相互之間的協(xié)同效應(yīng)。

微生物接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、水分含量等因素也對(duì)發(fā)酵效果有著重要的影響。本研究利用L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察了4菌混合發(fā)酵的最優(yōu)發(fā)酵參數(shù),試驗(yàn)獲得的混菌發(fā)酵最適參數(shù)為:培養(yǎng)溫度38℃,培養(yǎng)時(shí)間4.5d,料水比1∶1.3,接種量1×106個(gè)/g,接種比例1∶1∶2∶1。傅婭梅對(duì)復(fù)合蛋白質(zhì)飼料適宜的發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行探討,發(fā)現(xiàn)最適參數(shù)為:發(fā)酵時(shí)間2.5d,加水量65%,接種量10%,枯草芽孢桿菌:產(chǎn)朊假絲酵母:植物乳酸桿菌為1∶1∶1;胡瑞等用復(fù)合益生菌發(fā)酵豆粕,發(fā)現(xiàn)在復(fù)合益生菌(釀酒酵母∶米曲霉∶枯草芽孢桿菌=5∶1∶2)總添加量0.5%,料水比1∶0.4,發(fā)酵48h小效果最佳。

陳松等利用產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉、枯草芽孢桿菌和黑曲霉混菌發(fā)酵蘋(píng)果渣,發(fā)酵后基質(zhì)粗蛋白質(zhì)含量較發(fā)酵前提高了108%。王叔軍等向甘薯渣中添加少量的麩皮和尿素作為氮源,用微生物進(jìn)行混菌發(fā)酵后,粗蛋白質(zhì)含量提高到42.4%。趙啟美等采用固液結(jié)合的方法,發(fā)酵甘薯渣后,粗蛋白質(zhì)含量提高了58.4%;粗纖維含量由25.3%下降到14.2%。本研究中,發(fā)酵后產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和灰分含量顯著提高。但發(fā)酵后粗纖維含量沒(méi)有下降,反而有所上升,可能原因在于甘薯渣在提取淀粉過(guò)程中,因淀粉提取程度不同,造成甘薯渣粗纖維含量差異很大,本研究中所用原料粗纖維只有8.8%,低于資料報(bào)道的27%的水平。因此發(fā)酵時(shí)微生物優(yōu)先利用淀粉生長(zhǎng),這也是本研究中甘薯渣發(fā)酵后與湯小鵬等發(fā)酵木薯渣相比,本試驗(yàn)中產(chǎn)物中淀粉酶活性高,而CMCase等纖維素降解酶活性相對(duì)較低的原因。多菌混菌固態(tài)發(fā)酵,可有效提高產(chǎn)物中FPA、CMCase和淀粉酶等活性,本研究采用4種不同菌株混菌發(fā)酵,產(chǎn)物中檢測(cè)出了FPA、CMCase、β-葡萄糖苷酶和淀粉酶等活性。微生物在發(fā)酵過(guò)程中,利用發(fā)酵底物提供的氮源和碳源進(jìn)行繁殖、生長(zhǎng),消耗部分底物,導(dǎo)致底物干物質(zhì)含量降低,從而使粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分含量相對(duì)提高,但是通過(guò)微生物發(fā)酵,一方面微生物可將甘薯渣中低質(zhì)量蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為高質(zhì)量菌體蛋白,提高蛋白質(zhì)質(zhì)量;另一方面固態(tài)發(fā)酵后產(chǎn)生的各種酶,以及微生物發(fā)酵過(guò)程中累積大量營(yíng)養(yǎng)豐富的菌體蛋白及許多微生物代謝產(chǎn)物,間接提高了發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,可望使甘薯渣營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到進(jìn)一步改善。此外,混菌發(fā)酵時(shí)有益微生物的競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng),可望有效抑制導(dǎo)致甘薯渣腐爛變質(zhì)的有害微生物如黑根霉(Rhizopus stolonifer)軟腐菌生長(zhǎng),提高甘薯渣的存儲(chǔ)價(jià)值。

4結(jié) 論

①通過(guò)L16(45)正交試驗(yàn)得到多菌混合發(fā)酵甘薯渣的最優(yōu)條件為:發(fā)酵溫度38℃,發(fā)酵時(shí)間4.5d,料水比1∶1.3,接種量1×106個(gè)/g,接種比例為黑曲霉2∶里氏木霉∶枯草芽孢桿菌1∶釀酒酵母1=1∶1∶2∶1。

②以最優(yōu)條件混菌發(fā)酵甘薯渣后,發(fā)酵產(chǎn)物中可檢測(cè)到CMCase、FPA、β-葡萄糖苷酶和淀粉酶等酶活性。與對(duì)照相比,以干物質(zhì)為基礎(chǔ),發(fā)酵后顯著提高了產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和還原糖含量。發(fā)酵后粗纖維含量沒(méi)有下降,反而有所上升。

 

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