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不同青貯原料中的微生物無(wú)論是在種類上還是數(shù)量上都有很大的區(qū)別，青貯飼料中干物質(zhì)含量、可溶性碳水化合物含量、緩沖力等影響其附生微生物的種類和數(shù)量。有研究者對(duì)同一地區(qū)的高粱、苜蓿、黑麥草和玉米表面的附生的微生物進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，青貯飼料附生微生物主要包括乳酸菌、酵母菌、霉菌和其他好氧細(xì)菌等( 表1) 。

青貯飼料發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的微生物群落演變過(guò)程。青貯飼料開始發(fā)酵時(shí)好氧細(xì)菌處于活躍期，當(dāng)發(fā)酵體系中的氧氣被消耗完，乳酸菌開始大量增殖并產(chǎn)生乳酸降低發(fā)酵體系pH，腐敗微生物被抑制。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵體系pH 繼續(xù)降低，乳桿菌科( Lactobacillaceae) 逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位。陶蓮等采用MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)分析了自然青貯前后玉米秸稈中菌群結(jié)構(gòu)的變化，與青貯前相比，青貯發(fā)酵增加了厚壁菌門( Firmicutes)、芽孢桿菌綱( Bacilli) 、乳桿菌目( Lactobacillales)、乳桿菌科、片球菌屬( Pediococcus) 和乳桿菌屬( Lactobacillus) 細(xì)菌的數(shù)量，而降低了變形菌門( Proteobacteria) 和腸桿菌科( Enterobacteriaceae)細(xì)菌的數(shù)量。韓吉雨采用聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳( PCR-DGGE) 技術(shù)對(duì)玉米和苜蓿青貯發(fā)酵過(guò)程中菌群結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，青貯前期乳酸球菌數(shù)量較多，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乳酸桿菌逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌種。國(guó)內(nèi)關(guān)于青貯飼料表面附生微生物種類及其代謝產(chǎn)物的報(bào)道較少，而微生物在青貯過(guò)程中的代謝產(chǎn)物對(duì)青貯有氧穩(wěn)定性起著至關(guān)重要的作用，分析附生微生物在青貯過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化及其代謝產(chǎn)物的特性對(duì)青貯飼料品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性都有很重要的影響。

青貯過(guò)程中的微生物大致可以分為兩類: 1)有利于飼料發(fā)酵并保存飼料營(yíng)養(yǎng)特性的理想微生物，如乳酸菌等; 2) 不利于青貯飼料的儲(chǔ)藏，導(dǎo)致青貯飼料有氧變質(zhì)的微生物，如酵母菌、霉菌和梭菌等好氧性細(xì)菌。

2.1 提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性的微生物

乳酸菌是青貯飼料中重要的有益微生物。根據(jù)乳酸菌代謝產(chǎn)物的不同將其分為同型發(fā)酵乳酸菌和異型發(fā)酵乳酸菌。同型發(fā)酵乳酸菌可以產(chǎn)生較多的乳酸，能夠提高青貯發(fā)酵品質(zhì); 而異型發(fā)酵乳酸菌可以產(chǎn)生乳酸和揮發(fā)性脂肪酸，能夠抑制好氧細(xì)菌的生長(zhǎng)，提高青貯有氧穩(wěn)定性。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的研究和實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，異型發(fā)酵乳酸菌中的布氏乳桿菌( Lactobacillus buchneri) 和希氏乳桿菌( Lactobacillus hilgardii) 等在改善青貯飼料有氧穩(wěn)定性方面效果顯著。最近，研究人員還發(fā)現(xiàn)Lactobacillus parafarraginis、產(chǎn)細(xì)菌素菌株和非乳酸菌細(xì)菌也可以顯著改善青貯飼料有氧穩(wěn)定性。

2.1.1 Lactobacillus buchneri

Lactobacillus buchneri 可以將乳酸厭氧轉(zhuǎn)化為乙酸和1，2-丙二醇，乙酸通過(guò)抑制腐敗菌的生長(zhǎng)改善青貯飼料的有氧穩(wěn)定性，這一結(jié)論已經(jīng)被許多研究人員證實(shí)。Wang 等研究了Lactobacillus buchneri 單獨(dú)或與植物乳桿菌組合接種對(duì)鞭草青貯飼料有氧穩(wěn)定性的影響，結(jié)果顯示，Lactobacillus buchneri 單獨(dú)或與植物乳桿菌組合接種相比于其他處理顯著增加了青貯飼料的乙酸含量，酵母菌和霉菌的活性受到抑制，尤其是酵母菌; 并通過(guò)在有氧暴露期間有較低的pH、CO₂含量和酵母菌及霉菌數(shù)量反映出Lactobacillus buchneri 改善了鞭草青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。Gandra 等采用Lactobacillus buchneri 對(duì)向日葵進(jìn)行青貯試驗(yàn)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，接種Lactobacillus buchneri增加了青貯飼料的乙酸含量，有氧暴露期間霉菌和酵母菌數(shù)量顯著降低。許多研究表明Lactobacillus buchneri 在青貯后期才開始大量增殖，產(chǎn)生較多的乙酸，從而改善青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。Jin 等比較了單獨(dú)添加Lactobacillus buchneri 和混合添加Lactobacillus buchneri 與外源性纖維蛋白酶對(duì)青貯大麥的影響，結(jié)果顯示，青貯第1 ～ 7天，對(duì)照組中Lactobacillus buchneri 數(shù)量從6.5 lg( 拷貝數(shù)/g) 增加到8.0 lg ( 拷貝數(shù)/g) ，此后保持穩(wěn)定，而試驗(yàn)組中Lactobacillus buchneri 數(shù)量則從7. 0 lg ( 拷貝數(shù)/g ) 增加到10.0 lg( 拷貝數(shù)/g) ; 試驗(yàn)組中Lactobacillus buchneri數(shù)量在青貯第28 天達(dá)到10.5 lg( 拷貝數(shù)/g) ，此時(shí)具有較低的pH，產(chǎn)生了較多的乙酸和乙醇，但是比對(duì)照組產(chǎn)生的乳酸要少; 有氧暴露第21天，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組pH 和酵母菌的數(shù)量都顯著降低。Daughtry 等在腌制黃瓜時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同的Lactobacillus buchneri 對(duì)乳酸利用率和程度各不相同，目前還不清楚青貯飼料中天然存在的Lactobacillus buchneri 是否存在類似情況。

最初認(rèn)為L(zhǎng)actobacillus buchneri 不能將1，2-丙二醇進(jìn)一步代謝為丙醇和丙酸。Zielińska 等經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，Lactobacillus buchneri AKKP 2047p能夠?qū)?，2-丙二醇代謝成丙酸，并且葡萄糖和鈷胺素對(duì)其代謝有促進(jìn)作用。Lactobacillus buchneri在青貯后期開始大量增殖，逐漸成為主要的優(yōu)勢(shì)菌種，了解其在發(fā)酵過(guò)程中成為優(yōu)勢(shì)菌種的原因，可以幫助我們更好地了解提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性的微生物特性。

2.1.2 Lactobacillus hilgardii

Lactobacillus hilgardii 屬于異型發(fā)酵乳酸菌，在青貯發(fā)酵過(guò)程中可以產(chǎn)生較高含量的乙酸，有氧暴露階段高含量的乙酸抑制酵母菌和霉菌的生長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。Reis 等評(píng)估了從甘蔗青貯飼料中分離的Lactobacillus hilgardii CCMA 0170 對(duì)玉米青貯飼料的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Lactobacillus hilgardii CMA0170 減少了干物質(zhì)損失，并保存了更多的可溶性碳水化合物，同時(shí)，試驗(yàn)組中乳酸菌群、乳酸、乙酸以及1，2-丙二醇的含量增加，有氧暴露后絲狀真菌和酵母菌數(shù)量小于可檢測(cè)的最小值［＜2.0 lg ( CFU /g) ］。ávila 等用Lactobacillus hilgardii UFLA SIL 51 和UFLA SIL 52 處理甘蔗尾后青貯，與對(duì)照處理和用短乳桿菌處理相比，可以產(chǎn)生更高含量的乙酸和1，2-丙二醇，丁酸、干物質(zhì)損失和乙醇含量顯著降低，同時(shí)有氧暴露期間可以保持較低的酵母菌及霉菌數(shù)量。Polukis等采用Lactobacillus hilgardii  CNCM I-4785 或Lactobacillus buchneri 40788 青貯新鮮高水分玉米，結(jié)果顯示，與未經(jīng)處理的玉米青貯飼料相比，這2 種菌株都增加了青貯飼料中乙酸和1，2-丙二醇的含量，并使酵母菌數(shù)量減少; 發(fā)酵10 d 后，未處理的青貯飼料有氧穩(wěn)定性為22 h，而Lactobacillus hilgardii CNCM I-4785 和Lactobacillus buchneri 40788 處理的青貯飼料有氧穩(wěn)定性分別增加至42 和56 h; 發(fā)酵30 和90 d 后經(jīng)Lactobacillus hilgardii CNCM I-4785 或Lactobacillus buchneri 40788 處理的青貯飼料有氧穩(wěn)定性超過(guò)250 h，而未經(jīng)處理的青貯飼料有氧穩(wěn)定性為31 ～ 49 h。

接種同型發(fā)酵乳酸菌降低了青貯飼料中乙酸的含量，促進(jìn)了酵母菌生長(zhǎng)的速率，導(dǎo)致青貯飼料有氧穩(wěn)定性降低，因此，借助Lactobacillus hilgardii產(chǎn)生較多乙酸的特點(diǎn)，將其與同型發(fā)酵乳酸菌組合，對(duì)青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性或許能夠產(chǎn)生更好的效果。

2.1.3 Lactobacillus parafarraginis

Lactobacillus parafarraginis 是近幾年研究人員新發(fā)現(xiàn)的能夠改善青貯飼料有氧穩(wěn)定性的乳酸菌物種。Xu 等 研究發(fā)現(xiàn)，接種Lactobacillus parafarraginis 的玉米青貯飼料，在青貯前期觀察到pH 迅速降低，并且出現(xiàn)高含量的乳酸和乙酸;青貯第45 天時(shí)，接種Lactobacillus parafarraginis的玉米青貯飼料中Lactobacillus parafarraginis 成為主要的優(yōu)勢(shì)菌，比例為61. 63%，同時(shí)可以觀察到乳酸含量降低以及乙酸和1，2-丙二醇含量增加，并降低了氨態(tài)氮( NH₃-N) 與總氮的比值，有效提高了玉米青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。

乙酸一直以來(lái)被認(rèn)為是提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性最好的解釋。然而，Liu 等比較了新型細(xì)菌菌株Lactobacillus parafarraginis ZH1( ZH1 組)與植物乳桿菌Chikuso-1 ( LP 組) 和Lactobacillusbuchneri NCIMB 40788 ( LB 組) 對(duì)燕麥青貯飼料有氧穩(wěn)定性和鑒定抗酵母菌物質(zhì)的影響，結(jié)果顯示，ZH1 組產(chǎn)生的乙酸、苯甲酸和十六烷酸多于LP、LB 組，并具有最佳的有氧穩(wěn)定性; 此外，苯甲酸和十六烷酸在純培養(yǎng)物中對(duì)靶酵母具有最小的抑制濃度，Lactobacillus parafarraginis ZH1 具有更強(qiáng)的抗酵母菌潛力，并且比其他菌株更有效地改善了燕麥青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。Broberg 等報(bào)道，接種乳酸菌的青貯飼料能夠產(chǎn)生3-羥基癸酸、水楊酸、苯甲酸、兒茶酚、氫化肉桂酸、3-苯基乳酸和4-羥基苯甲酸等抗菌化合物，青貯飼料有氧暴露穩(wěn)定性得到延長(zhǎng)。因此，多種抗菌化合物或其協(xié)同效應(yīng)可以解釋除了乙酸以外改善青貯飼料有氧穩(wěn)定性產(chǎn)生的較好效果，這也為我們研發(fā)改善青貯飼料有氧穩(wěn)定性新的添加劑組合提供了理論依據(jù)。

2.1.4 產(chǎn)細(xì)菌素的細(xì)菌

近年來(lái)，具有生物防腐劑潛力的細(xì)菌素和產(chǎn)細(xì)菌素的菌株成為研究的焦點(diǎn)。細(xì)菌素是由不同微生物產(chǎn)生的抗微生物蛋白( 肽) ，對(duì)于與其密切相關(guān)的細(xì)菌具有拮抗活性。最近，Amado 等研究了乳球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素pediocin SA-1 作為添加劑對(duì)青貯玉米的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，pediocin SA-1 具有很好的抗菌活性，有效地降低了玉米青貯中李斯特菌數(shù)量，并且提高了乙酸和1，2－丙二醇的含量以及降低了殘余糖的含量，延長(zhǎng)了青貯飼料有氧暴露的時(shí)間。PCR-DGGE 分析顯示，添加細(xì)菌素不影響自發(fā)發(fā)酵的細(xì)菌群落。Marciñaková 等報(bào)道了產(chǎn)細(xì)菌素的屎腸球菌對(duì)青貯牧草有氧穩(wěn)定性的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組pH 降低更快，乳酸含量升高，乙酸和丁酸含量降低，在有氧暴露的7 d 中pH 均低于4.3，李斯特菌和霉菌的數(shù)量減少。Ganzorig 等發(fā)現(xiàn)由希氏乳桿菌Uvu-21 和Lactobacillus diolivoransTuv-33 產(chǎn)生的2 種上清液具有有效的抗菌和蛋白質(zhì)水解活性，經(jīng)蛋白酶處理后活性消失，表明該生物活性源自乳酸菌產(chǎn)生的肽。Parvin等發(fā)現(xiàn)，巴氏醋桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素可有效地抑制酵母菌的增殖，青貯飼料的有氧穩(wěn)定性得到顯著提高。

細(xì)菌素的發(fā)現(xiàn)對(duì)提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性具有潛在的作用，但對(duì)于使用產(chǎn)細(xì)菌素的細(xì)菌進(jìn)行青貯試驗(yàn)研究的甚少。因此，挖掘產(chǎn)細(xì)菌素的菌株及其對(duì)青貯飼料有氧穩(wěn)定性的影響值得進(jìn)一步研究。

2.1.5 非乳酸菌細(xì)菌

近年來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)了幾種能夠改善青貯飼料有氧穩(wěn)定性的非乳酸菌物種，主要為枯草芽孢桿菌和丙酸桿菌等微生物。Lara 等比較了3種處理( 未處理、枯草芽孢桿菌處理和枯草芽孢桿菌+ Lactobacillus plantarum 處理) 的玉米青貯飼料，青貯96 d 后，枯草芽孢桿菌處理中酵母菌數(shù)量最低，而其他2 種處理中酵母菌數(shù)量相似?？莶菅挎邨U菌和枯草芽孢桿菌+Lactobacillus plantarum處理的青貯飼料的有氧穩(wěn)定性分別比未處理的青貯飼料高3 倍以上和2 倍。Gandra 等研究了Lactobacillus buchneri 和Lactobacillus buchneri+枯草芽孢桿菌對(duì)甘蔗青貯飼料的影響，結(jié)果顯示，與Lactobacillus buchneri 處理相比，Lactobacillus buchneri +枯草芽孢桿菌處理的乙酸含量更高，丁酸含量更低。Zachary采用丙酸桿菌處理青貯玉米，青貯30 和90 d 后，與對(duì)照組相比，具有較低的pH，較高的丙酸和乙酸含量，有氧穩(wěn)定性測(cè)試中一氧化碳( CO) 含量最少，酵母菌數(shù)量低于可檢測(cè)水平。

枯草芽孢桿菌可能是通過(guò)產(chǎn)生抑制酵母菌和霉菌的類似細(xì)菌素的代謝物來(lái)提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性，這一結(jié)論還需要作進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。即便如此，枯草芽孢桿菌和丙酸桿菌等非乳酸菌物種改善青貯飼料有氧穩(wěn)定性的試驗(yàn)還是為預(yù)測(cè)和研發(fā)新的添加劑指明了方向。

2.2 降低有氧穩(wěn)定性的微生物

2.2.1 酵母菌和霉菌

酵母菌一直以來(lái)被認(rèn)為是導(dǎo)致青貯飼料有氧變質(zhì)的主要微生物。引起青貯飼料有氧變質(zhì)的酵母菌分為兩類: 一類是利用酸，如假絲酵母屬( Candida) 、擬內(nèi)孢霉屬( Endomycopsis ) 、漢遜酵母屬( Hansenula) 和畢赤酵母屬( Pichia) ; 一類是利用糖，如球擬酵母屬(Torulopsis ) 。Wang等研究了全混合日糧( TMR) 中酵母菌在有氧變質(zhì)過(guò)程中的作用，結(jié)果顯示，盔形畢赤酵母( Pichia manshurica) 、嗜酒假絲酵母( Candida ethanolica)、拜氏接合酵母( Zygosaccharomyces bailii)能夠耐受乙酸，對(duì)青貯早期時(shí)青貯有氧變質(zhì)產(chǎn)生更多的影響; 青貯后期，Zygosaccharomyces bailii是引起青貯飼料有氧變質(zhì)的主要酵母菌。Carvalho等在青貯甘蔗尾研究中發(fā)現(xiàn)青貯飼料的有氧變質(zhì)與主要酵母菌的新陳代謝密切相關(guān)，Candida、Schizosaccharomyces pombe和Zygosaccharomyces bailii 是降低青貯飼料有氧穩(wěn)定性的主要微生物。Hao 等研究發(fā)現(xiàn)，青貯飼料有氧暴露期間，Zygosaccharomyces bailii 數(shù)量的增加引起TMR 的有氧變質(zhì)。

絕大部分研究者認(rèn)為酵母菌是引起青貯飼料有氧變質(zhì)的主要群體，而有一部分研究者卻持相反態(tài)度。Savage 等將2 株釀酒酵母和1 種未知酵母菌接種到玉米青貯中，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，3 種菌株對(duì)青貯飼料的有氧穩(wěn)定性菌沒有產(chǎn)生顯著影響。研究發(fā)現(xiàn)，在青貯甘蔗尾中添加開菲爾乳桿菌( Lactobacillus kefiri) 或短乳桿菌( Lactobacillus brevis) 均降低了酵母菌的數(shù)量，但并未改變其有氧穩(wěn)定性。有研究者還發(fā)現(xiàn)，有些酵母菌可以產(chǎn)生抑制其他真菌及革蘭氏陰性菌活性的代謝物。從高水分小麥中分離的異常畢赤酵母( Pichia anomala) J121 接種大麥比未處理的大麥具有更高的酵母菌數(shù)量( 超過(guò)100 倍) ，然而，霉菌和腸桿菌數(shù)量低于可檢測(cè)水平。Schnürer等也證實(shí)了Pichia anomala J121 菌株抑制真菌及某些革蘭氏陰性菌活性的結(jié)論。酵母菌代謝產(chǎn)物及其在青貯飼料有氧變質(zhì)中的作用應(yīng)有更多的數(shù)據(jù)來(lái)闡述，采用抑制真菌及某些革蘭氏陰性菌的酵母菌進(jìn)行青貯接種值得進(jìn)一步探討分析。

霉菌是嚴(yán)格的好氧性微生物。Orsi 等檢測(cè)和分析了195 份青貯玉米中霉菌的種類和數(shù)量，鐮刀霉菌屬是最多的，其次為曲霉菌屬、青霉菌屬、毛孢子菌屬和分子孢子菌屬，這些菌屬可以降解玉米中的糖和乳酸，導(dǎo)致青貯飼料發(fā)熱變暖，降低青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。Macêdo 等報(bào)道，煙曲霉菌( Aspergillus fumigatus) 是引起青貯飼料溫度升高和有氧變質(zhì)的一種真菌。反芻動(dòng)物攝食變質(zhì)的青貯飼料，不僅會(huì)損害動(dòng)物本身的健康，最終也會(huì)通過(guò)肉類和乳制品將毒素傳遞給人類。因此，抑制霉菌產(chǎn)生是動(dòng)物飼料和營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域中不可忽視的環(huán)節(jié)。

2.2.2 梭菌

梭菌屬于厭氧微生物，其主要產(chǎn)物為丁酸，對(duì)青貯飼料有氧穩(wěn)定性產(chǎn)生負(fù)面影響。張大偉等報(bào)道，梭菌在生長(zhǎng)過(guò)程中，通過(guò)脫氫、脫羧和氧化還原等方式使蛋白質(zhì)腐敗，引起青貯飼料變質(zhì)。Jatkauskas 等在青貯玉米有氧穩(wěn)定性的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，降低青貯飼料中梭菌的數(shù)量以及丁酸、氨態(tài)氮的含量后有氧穩(wěn)定性提高了66 ～ 312 h。Vukmirovic等在苜蓿青貯中發(fā)現(xiàn)，降低梭菌的數(shù)量后青貯飼料的有氧穩(wěn)定性比對(duì)照組提高了3 倍。由此可見，抑制梭菌及丁酸的產(chǎn)生對(duì)青貯飼料有氧穩(wěn)定性至關(guān)重要。

抑制好氧微生物的生長(zhǎng)，改善青貯飼料的有氧穩(wěn)定性一直以來(lái)都是青貯飼料研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)的能夠顯著提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性的乳酸菌屬大多是在青貯后期才開始發(fā)揮作用，利用新的技術(shù)分析植物附生微生物種類及其在青貯發(fā)酵過(guò)程中的演替，能夠在青貯早期識(shí)別提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性的菌株，對(duì)改善青貯飼料有氧穩(wěn)定性將有很大幫助。