一株丁酸梭菌的分離鑒定及其益生特性研究

2020-10-29 15:08:54 點擊：

摘要：本研究探索了丁酸梭菌分離株的益生特性，旨在為其在仔豬日糧中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。利用常規(guī)方法分離丁酸梭菌并進行純培養(yǎng)，經(jīng)生化檢測和１６Ｓ?。颍遥危粱驕y序，對分離菌株進行鑒定；采用活菌計數(shù)法和牛津杯法研究分離株培養(yǎng)上清對３種致病菌的抑制作用、分離株黏附豬小腸上皮細胞（ＩＰＥＣ－Ｊ２）的特性及其對致病菌黏附細胞的抑制作用；采用細胞計數(shù)法研究分離株對ＩＰＥＣ－Ｊ２生長的影響；采用ＥＬＩＳＡ檢測分離株處理細胞后培養(yǎng)上清液中細胞因子水平。結(jié)果表明，本研究成功分離到一株丁酸梭菌。與對照組相比，丁酸梭菌培養(yǎng)上清對３種致病菌生長抑制效果均顯著（Ｐ＜０.０５）；丁酸梭菌可黏附于ＩＰＥＣ－Ｊ２，并且黏附效果最佳的感染復(fù)數(shù)（ＭＯＩ）為５０，最適處理時長為３ｈ；丁酸梭菌對３種致病菌黏附ＩＰＥＣ－Ｊ２均具有顯著抑制作用（Ｐ＜０.０５）；丁酸梭菌ＭＯＩ為１、１０和５０時細胞生長正常、形態(tài)完好，ＭＯＩ為１００時ＩＰＥＣ－Ｊ２生長受到顯著抑制，同時出現(xiàn)部分細胞死亡；ＭＯＩ為１時細胞因子水平無差異，ＭＯＩ為１０、５０和１００時細胞因子水平均顯著增高（Ｐ＜０.０５）。綜上所述，本研究分離的一株丁酸梭菌具有較好的益生特性，為其在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

仔豬出生后通過母乳獲得免疫保護，而斷奶后常表現(xiàn)出抵抗力下降，易發(fā)生腹瀉，死亡率增加。致病性細菌是引起仔豬腸道疾病的一類病原，例如常見的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ?。澹螅悖瑁澹颍椋悖瑁椋帷。悖铮欤?，ＥＴＥＣ）和沙門氏菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ），引起仔豬腹瀉，給豬生產(chǎn)帶來了一定的經(jīng)濟損失。為了提高養(yǎng)豬效益，通常在飼料中添加抗生素來防治疾病。雖然抗生素在預(yù)防動物疾病、促進畜禽生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率和畜產(chǎn)品品質(zhì)等方面起到了重要作用，但隨著抗生素的大量使用，出現(xiàn)了耐藥菌株和抗生素殘留等問題，嚴重威脅到畜牧業(yè)自身效益和人類健康。

近年來，人們開始研究利用益生菌調(diào)節(jié)仔豬腸道菌群平衡和免疫發(fā)育，以減少或替代抗生素的使用，提高仔豬抗病力。丁酸梭菌是人和動物腸道內(nèi)的正常菌群，具有調(diào)整腸道微生態(tài)平衡、產(chǎn)生益生產(chǎn)物和增強機體免疫等作用。２００３年歐盟批準丁酸梭菌作為飼料添加劑用于斷奶仔豬和肉雞。２００９年７月，原農(nóng)業(yè)部批準丁酸梭菌可作為飼料添加劑用于生產(chǎn)，并于２０１３年將其納入《中國飼料添加劑品種目錄（２０１３）》的《附錄二》中。目前，丁酸梭菌在提高畜禽生產(chǎn)性能、防治動物細菌性疾病和提高動物性食品安全等方面已經(jīng)表現(xiàn)出積極的作用。

本研究從健康仔豬糞便中分離鑒定出一株丁酸梭菌，探索該分離株培養(yǎng)上清液對致病性大腸桿菌和沙門氏菌的生長抑制作用，對兩類致病菌黏附豬小腸上皮細胞（ＩＰＥＣ－Ｊ２）的抑制作用以及對ＩＰＥＣ－Ｊ２生長和免疫反應(yīng)的影響，以期為丁酸梭菌在仔豬日糧中的廣泛應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

１　材料與方法

１.１　細胞和菌株

ＩＰＥＣ－Ｊ２、豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌Ｋ８８均為天津師范大學(xué)生命科學(xué)院動物營養(yǎng)與飼料實驗室保存。

１.２　主要試劑

ＲＰＭＩ　Ｍｅｄｉｕｍ　１６４０?。猓幔螅椋闩囵B(yǎng)基、胰蛋白酶ＥＤＴＡ消化液和胎牛血清均購自Ｇｉｂｃｏ公司；青鏈霉素、硫酸慶大霉素和ＴｒｉｔｏｎＸ－１００均購自北京索萊寶生物公司；ＴＲＩｚｏｌ試劑盒、Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰｓ均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；豬白細胞介素－１β（ＩＬ－１β）、豬白細胞介素－８（ＩＬ－８）、豬腫瘤壞死因子（ＴＮＦ－α）檢測試劑盒均購自ＢＤ公司。

１.３　主要培養(yǎng)基

梭菌選擇培養(yǎng)基（ＴＳＮ培養(yǎng)基），用于丁酸梭菌的分離培養(yǎng)，其配方為：胰蛋白胨１７ｇ／Ｌ、大豆蛋白胨３ｇ／Ｌ、氯化鈉５ｇ／Ｌ、磷酸二氫鉀２.５ｇ／Ｌ和葡萄糖２.５ｇ／Ｌ；梭菌增殖培養(yǎng)基（ＲＣＭ培養(yǎng)基），用于丁酸梭菌的純培養(yǎng)，其配方為：酵母浸粉３ｇ／Ｌ、牛肉膏１０ｇ／Ｌ、蛋白胨１０ｇ／Ｌ、可溶性淀粉１ｇ／Ｌ、葡萄糖５ｇ／Ｌ、半胱氨酸鹽酸鹽０.５ｇ／Ｌ、氯化鈉３ｇ／Ｌ和乙酸鈉３ｇ／Ｌ；ＬＢ培養(yǎng)基由胰蛋白胨１０ｇ／Ｌ、酵母浸粉５ｇ／Ｌ和氯化鈉１０ｇ／Ｌ組成；普通肉湯培養(yǎng)基由蛋白胨１０ｇ／Ｌ、牛肉膏５ｇ／Ｌ和氯化鈉５ｇ／Ｌ組成。上述各培養(yǎng)基分別加入２％瓊脂即可配成固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基所用的各種化學(xué)試劑均為化學(xué)純。

１.４　丁酸梭菌的分離

無菌稱取健康斷奶仔豬的新鮮糞便５ｇ，用無菌生理鹽水稀釋至１０－５、１０－６、１０－７３個梯度，分別?。玻埃唉蹋碳S便稀釋液接種于ＴＳＮ培養(yǎng)基中，置于３７℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置厭氧培養(yǎng)４８ｈ，觀察菌落形態(tài)特征。對可疑菌落進行革蘭氏染色，用顯微鏡油鏡觀察不同菌落的菌體特征和染色特性，選取符合丁酸梭菌形態(tài)特征的菌落劃線接種ＲＣＭ培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直到得到可疑菌落的純培養(yǎng)物。

１.５　丁酸梭菌生理生化及１６Ｓ?。颍模危凌b定

參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》對可疑菌落的純培養(yǎng)物進行生理生化鑒定。鑒定項目包括硝酸鹽還原、明膠液化、吲哚、硫化氫產(chǎn)生以及蜜二糖、松三糖和淀粉的發(fā)酵。

將細菌通用引物（２７Ｆ：５′－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣ－ＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３′；１４９２Ｒ：５′－ＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴ－ＴＡＣ?。牵粒茫裕裕场洌┪猩ど锕こ蹋ㄉ虾＃┕煞萦邢薰竞铣?。離心收集培養(yǎng)至對數(shù)生長期的分離株純培養(yǎng)物，采用ｔａｃｏ試劑盒提取基因組ＤＮＡ，以其為模板，對細菌１６ＳｒＤＮＡ進行ＰＣＲ擴增。ＰＣＲ反應(yīng)參考梁東梅等報道，ＰＣＲ體系５０μＬ：ＤＮＡ模板２μＬ，Ｔａｑ酶（５Ｕ／μＬ）１μＬ，ｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，上、下游引物各１μＬ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ?。郸蹋?，ｄｄＨ２Ｏ　３９μＬ。ＰＣＲ反應(yīng)條件：９４℃預(yù)變性５ｍｉｎ；９４℃變性２５ｓ，６２℃退火２５ｓ，７２℃延伸９０ｓ，４０個循環(huán)；７２℃終延伸３ｍｉｎ；１６℃２ｍｉｎ。利用１.０％瓊脂糖凝膠對ＰＣＲ擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，將擴增片段大小為１?。担埃埃猓鹱笥业年栃援a(chǎn)物進行純化，純化產(chǎn)物送金唯智生物公司進行核苷酸序列測定。利用ＮＣＢＩ數(shù)據(jù)庫中的ＢＬＡＳＴ工具將測序結(jié)果進行同源性分析，確定分離株的屬種。

１.６　丁酸梭菌抑制致病菌能力的測定

將丁酸梭菌接種于ＲＣＭ培養(yǎng)基，３７℃靜置過夜培養(yǎng)４８ｈ，離心，收集培養(yǎng)上清液，置４℃保存，用于分析其培養(yǎng)液抑菌能力。

１.６.１　牛津杯法測量抑菌圈直徑　　

試驗方法參考梁東梅等報道，將２.０％瓊脂水傾注于培養(yǎng)皿中，待凝固后等距離放入４個牛津杯，將含致病菌（濃度為１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）的ＬＢ固體培養(yǎng)基混勻后緩注入平板中，待培養(yǎng)基凝固后，用鑷子拔出牛津杯。?。保担唉蹋潭∷崴缶囵B(yǎng)液加入牛津杯中，同時用ＲＣＭ培養(yǎng)液作為空白對照，試驗組和對照組各做３個重復(fù)孔。將培養(yǎng)皿在４℃放置２ｈ，待孔內(nèi)液體完全擴散后轉(zhuǎn)至３７℃倒置培養(yǎng)２４ｈ，測量各孔抑菌圈直徑。

１.６.２　活菌計數(shù)法進行菌落計數(shù)　　

試驗方法參考梁東梅等報道，將丁酸梭菌培養(yǎng)液分別與大腸桿菌（濃度為１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）和沙門氏菌（濃度為１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）混合作用，每種致病菌分別做３個重復(fù)，作用時長均為０、５、１５、３０和６０ｍｉｎ，然后將致病菌倍比稀釋，大腸桿菌稀釋液涂布ＬＢ瓊脂板，沙門氏菌稀釋液涂布普通肉湯瓊脂板，３７℃培養(yǎng)２４ｈ，進行菌落計數(shù)。每個作用時間點分別做３次菌落計數(shù)。

１.７　丁酸梭菌對ＩＰＥＣ－Ｊ２生長的影響

用含１０％胎牛血清、１％青鏈霉素的ＤＭＥＭ－１６４０培養(yǎng)基培養(yǎng)ＩＰＥＣ－Ｊ２，培養(yǎng)條件是３７℃、５％ＣＯ２。將生長至對數(shù)期的細胞接種至１２孔細胞培養(yǎng)板，待細胞生長密度至８０％（細胞濃度為５×１０5地5個／孔），再分別加入ＭＯＩ（ＭＯＩ＝細菌數(shù)量／細胞數(shù)量）為１、１０、５０和１００的丁酸梭菌，同時設(shè)ＤＭＥＭ培養(yǎng)液作為空白對照組，每個處理組做３個重復(fù)孔。待丁酸梭菌處理細胞３ｈ后，棄掉培養(yǎng)液，用ＤＭＥＭ清洗３次細胞以去除未黏附的細菌，顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)及死亡情況。觀察結(jié)束后，將每孔細胞消化并收集于離心管中，１?。埃埃埃颍恚椋铍x心４ｍｉｎ，棄上清，加入不含血清的培養(yǎng)液將細胞吹打均勻，經(jīng)臺盼藍染色后，在顯微鏡下進行細胞計數(shù)。

１.８　丁酸梭菌黏附ＩＰＥＣ－Ｊ２能力的測定

１.８.１　丁酸梭菌黏附細胞的時間依賴性　　

將ＩＰＥＣ－Ｊ２接種至２４孔細胞培養(yǎng)板，待細胞生長密度至８０％，分別加入ＭＯＩ為５０的丁酸梭菌，３７℃分別孵育３、６、１２和２４ｈ，每個處理組做３個重復(fù)孔。孵育結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用ＤＭＥＭ清洗３次以去除未黏附的丁酸梭菌，然后每孔加入１００μＬ?。?５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，孵育８ｍｉｎ以裂解細胞，然后加９００μＬＰＢＳ終止裂解，吹打混勻后吸出樣品，最后將樣品進行梯度稀釋后涂板計數(shù)，即丁酸梭菌黏附數(shù)。

１.８.２　丁酸梭菌黏附細胞的劑量依賴性　　

細胞培養(yǎng)至２４孔板的方法同１.８.１，分別加入ＭＯＩ為１、１０、５０和１００的丁酸梭菌，３７℃孵育細胞３ｈ，每個濃度處理組做３個重復(fù)孔，用于丁酸梭菌黏附細胞數(shù)的測定。細胞裂解和細菌計數(shù)方法同１.８.１。

１.９　丁酸梭菌抑制致病菌黏附ＩＰＥＣ－Ｊ２能力的測定

將ＩＰＥＣ－Ｊ２接種至２４孔板，待細胞生長密度至８０％，用ＭＯＩ為５０的丁酸梭菌處理３ｈ，然后清洗細胞３次，以去除未黏附細胞的丁酸梭菌，再用大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌分別感染細胞０、３、６、１２和２４ｈ，感染劑量均為１×１０3ＣＦＵ／孔。感染結(jié)束后，按照１.８.１方法進行細胞裂解和致病菌計數(shù)，每個處理組的每個處理時間均做３個重復(fù)孔。

１.１０　丁酸梭菌對ＩＰＥＣ－Ｊ２免疫應(yīng)答的影響

將ＩＰＥＣ－Ｊ２接種于２４孔板，待細胞生長密度至８０％，分別使用ＭＯＩ為１、１０、５０和１００的丁酸梭菌作用ＩＰＥＣ－Ｊ２，以不加丁酸梭菌的處理為空白對照組，每個濃度處理做３個重復(fù)孔。丁酸梭菌處理細胞３ｈ后，收集培養(yǎng)上清液，按照檢測試劑盒說明書測定ＩＬ－１β、ＩＬ－８和ＴＮＦ－α。

１.１１　數(shù)據(jù)分析

使用Ｅｘｃｅｌ進行數(shù)據(jù)整理，采用ＳＰＳＳ　２０.０軟件ＯｎｅＷａｙＡＮＯＶＡ進行單因素方差分析，并采用ｔ檢驗進行組間差異性檢驗，結(jié)果以平均值±標準差表示，Ｐ＜０.０５為差異顯著。

２　結(jié)　果

２.１　分離株的生長性狀及顯微特征

將分離純化的菌株劃線接種于ＲＣＭ培養(yǎng)基，３７℃厭氧培養(yǎng)２４ｈ，可見菌落直徑１～３ｍｍ，呈圓形凸起、邊緣整齊、表面濕潤光滑有光澤、乳白色或淡奶油色、不透明，且略有酸臭味。將分離菌進行革蘭氏染色，油鏡下可見菌體為直桿狀或稍有彎曲，兩端鈍圓，革蘭氏染色呈陽性（圖１）。

２.２　分離株的生化及ＰＣＲ鑒定

對該分離株進行硝酸鹽還原、明膠液化、淀粉水解、糖發(fā)酵等試驗，其鑒定結(jié)果如表１。從菌落形態(tài)以及生化反應(yīng)結(jié)果來看，該菌株的特征與丁酸梭菌是一致的，初步鑒定該分離株為丁酸梭菌。

提取丁酸梭菌分離株的基因組，以其為模板進行１６ＳｒＤＮＡ的ＰＣＲ擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后結(jié)果見圖２，可見一條大小為１?。担埃埃猓鹱笥业奶禺愋詶l帶，與預(yù)期條帶大小相符。將目的條帶進行膠回收純化和核苷酸測序，并將測序結(jié)果在ＮＣ－ＢＩ數(shù)據(jù)庫中進行ＢＬＡＳＴ比對，結(jié)果表明，該菌株的１６ＳｒＤＮＡ基因序列與丁酸梭菌（ＮＣＢＩ登錄號：ＫＣ１９６７７７.１）同源性達１００％，因此確定該分離株為梭菌屬丁酸梭菌。

２.３　丁酸梭菌抑制致病菌的能力

丁酸梭菌培養(yǎng)上清液抑制致病菌能力的結(jié)果見表２和表３。其中表２為牛津杯法測定的試驗結(jié)果，對照組是ＲＣＭ培養(yǎng)液，其抑菌圈直徑為０ｍｍ，對致病菌無抑制作用，而丁酸梭菌培養(yǎng)上清液作用大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌后，抑菌圈直徑分別為２５.０、２６.３、２８.４ｍｍ。由此可知，丁酸梭菌培養(yǎng)上清對這３種致病菌均有良好的抑制作用，其中對鼠傷寒沙門氏菌的抑制作用最強。

活菌計數(shù)法試驗結(jié)果見表３。由表３可知，與丁酸梭菌培養(yǎng)上清液和大腸桿菌作用０ｍｉｎ相比，丁酸梭菌培養(yǎng)上清液作用大腸桿菌５、１５、３０、６０ｍｉｎ后抑菌力分別提高了５３.３３％、５６.６７％、６８.３３％、７８.３３％；與丁酸梭菌培養(yǎng)上清液和豬霍亂沙門氏菌作用０ｍｉｎ相比，丁酸梭菌培養(yǎng)上清液作用豬霍亂沙門氏菌５、１５、３０、６０ｍｉｎ后抑菌力分別提高了５６.６７％、６０.３３％、６９.６７％、７８.６７％；與丁酸梭菌培養(yǎng)上清液和鼠傷寒沙門氏菌作用０ｍｉｎ相比，丁酸梭菌培養(yǎng)上清液作用鼠傷寒沙門氏菌５、１５、３０、６０ｍｉｎ后抑菌力分別提高了５９.６７％、６１.３３％、７０.３３％、８３.３３％，并且隨著丁酸梭菌培養(yǎng)上清液作用時間的延長對這３種致病菌的抑制作用均有所增強。由此可見，牛津杯法和活菌計數(shù)法測定丁酸梭菌抑菌能力的試驗結(jié)果是一致的。試驗數(shù)據(jù)表明，丁酸梭菌能夠有效抑制３種致病菌的生長，抑制作用由強到弱依次為鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌和大腸桿菌。

２.４　丁酸梭菌對ＩＰＥＣ－Ｊ２生長的影響

用不同劑量的丁酸梭菌處理ＩＰＥＣ－Ｊ２細胞３ｈ，顯微鏡下觀察細胞生長狀況，當(dāng)ＭＯＩ為０、１、１０和５０時細胞生長狀況均良好，表現(xiàn)為細胞透明度大、折光性強、輪廓不清，當(dāng)ＭＯＩ為１００時，細胞折光性降低、輪廓增強、細胞之間空隙增大、細胞形態(tài)不規(guī)則，少量細胞甚至死亡，漂浮在細胞培養(yǎng)液中。由此可見，ＭＯＩ為１、１０和５０時丁酸梭菌對細胞的正常生長無可見影響，當(dāng)ＭＯＩ為１００時，丁酸梭菌會影響細胞的正常生長，造成細胞損傷甚至死亡。顯微鏡觀察后，將細胞消化收集，并進行臺盼藍染色和細胞計數(shù)，結(jié)果見圖３。由圖３可知，與對照組相比，ＭＯＩ為１、１０和５０時試驗組細胞數(shù)均無顯著差異，ＭＯＩ為１００時試驗組細胞數(shù)顯著降低（Ｐ＜０.０５），由此可見，丁酸梭菌處理濃度ＭＯＩ為１００時影響了細胞的正常生長。

２.５　丁酸梭菌黏附ＩＰＥＣ－Ｊ２的能力

不同作用時間對丁酸梭菌黏附ＩＰＥＣ－Ｊ２能力的影響見表４。由表４可知，與丁酸梭菌作用細胞３ｈ相比，丁酸梭菌作用細胞６、１２ｈ，其黏附指數(shù)分別增加４.９％、４.０％，丁酸梭菌作用２４ｈ時，黏附指數(shù)降低了１.８％，無顯著差異（Ｐ＞０.０５），其中作用時長為６ｈ時丁酸梭菌黏附細胞的數(shù)量最多，說明丁酸梭菌對豬腸上皮細胞具有很好的黏附性。不同作用濃度對丁酸梭菌黏附ＩＰＥＣ－Ｊ２能力的影響見表５。由表５可知，與ＭＯＩ為１相比，ＭＯＩ為１０、５０、１００時，丁酸核菌的黏附能力均顯著增加（Ｐ＜０.０５），且以ＭＯＩ為５０時丁酸梭菌的黏附能力最強。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，ＭＯＩ為１００時，較多的細胞形態(tài)發(fā)生了改變，并伴有部分細胞漂浮于培養(yǎng)液中，因此，丁酸梭菌處理濃度ＭＯＩ為１００時對細胞具有損傷作用。

２.６　丁酸梭菌對致病菌黏附ＩＰＥＧ－Ｊ２的影響

丁酸梭菌對致病菌黏附ＩＰＥＧ－Ｊ２的影響結(jié)果見表６。由表６可知，與大腸桿菌刺激細胞０ｈ相比，大腸桿菌刺激細胞３、６、１２和２４ｈ時，其黏附數(shù)分別降低了１１％、３６％、４３％和２５％；與豬霍亂沙門氏菌刺激細胞０ｈ相比，豬霍亂沙門氏菌刺激細胞３、６、１２和２４ｈ時，其黏附數(shù)分別降低了２５％、４０％、５０％和１７％；與鼠傷寒沙門氏菌刺激細胞０ｈ相比，鼠傷寒沙門氏菌刺激細胞３、６、１２和２４ｈ時，其黏附數(shù)分別降低了３５％、４７％、５５％和１６％；并且３種致病菌均以作用細胞１２ｈ時其黏附數(shù)降低為最多。試驗數(shù)據(jù)表明，丁酸梭菌能夠有效抑制３種致病菌黏附ＩＰＥＧ－Ｊ２，其抑制效果由強到弱依次是鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、大腸桿菌。

２.７　丁酸梭菌對ＩＰＥＣ－Ｊ２免疫應(yīng)答的影響

丁酸梭菌對ＩＰＥＣ－Ｊ２免疫應(yīng)答的影響見圖４，與對照組相比，丁酸梭菌處理濃度ＭＯＩ為１時，ＩＬ－１β、ＩＬ－８和ＴＮＦ－α的濃度均沒有顯著變化（Ｐ＞０.０５）；丁酸梭菌處理濃度ＭＯＩ為１０時，ＩＬ－８和ＴＮＦ－α的濃度均顯著增加（Ｐ＜０.０５），而ＩＬ－１β的濃度沒有顯著變化（Ｐ＞０.０５）；丁酸梭菌處理濃度ＭＯＩ為５０和１００時，ＩＬ－１β、ＩＬ－８和ＴＮＦ－α的濃度均顯著增加（Ｐ＜０.０５）。

３　討　論

３.１　丁酸梭菌抑菌能力

本研究分別采用牛津杯法和活菌計數(shù)法分析獲得丁酸梭菌分離株抑菌活性，結(jié)果表明丁酸梭菌分離株對大腸桿菌和沙門氏菌均具有很強的抑制作用。已有研究表明，丁酸梭菌可能通過丁酸、抗菌肽等物質(zhì)抑制致病菌的生長。賈麗楠等研究表明，丁酸梭菌發(fā)酵液上清對大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等均具有明顯的抑制作用，并且進一步研究發(fā)現(xiàn)，起抑菌作用的為有機酸、蛋白或多肽類物質(zhì)。威脅斷奶仔豬腸道健康的致病菌除大腸桿菌和沙門氏菌外，還有其他病原菌如丹毒桿菌和鏈球菌等，因此，丁酸梭菌對于其他動物腸道病原菌的生長繁殖是否具有抑制作用還有待進一步研究。

３.２　丁酸梭菌黏附及競爭性黏附能力

本研究的３種腸道致病菌均是通過定植于動物腸道產(chǎn)生一些對動物生長有害的產(chǎn)物，從而導(dǎo)致動物發(fā)病。大腸桿菌主要通過菌毛及纖毛蛋白結(jié)構(gòu)中的黏附因子定殖于小腸黏膜并與小腸黏膜上皮細胞上的相應(yīng)受體結(jié)合，釋放腸毒素引起腹瀉。沙門氏菌是引起６個月以下仔豬副傷寒的主要病原菌，菌體表面有菌毛，利于菌體在黏膜及組織細胞上黏附，不利于病原菌的清除。

丁酸梭菌發(fā)揮益生作用主要是通過定植在細胞表面后競爭營養(yǎng)物質(zhì)和黏附部位，從而阻擋病原菌與細胞表面的受體結(jié)合，達到抑制致病菌黏附細胞的目的，在一定程度上降低致病菌的增殖。由于在動物體內(nèi)很難準確的判定細菌對細胞的黏附能力，因此應(yīng)用體外細胞試驗研究細菌的黏附能力是目前最常用的方法。本研究采用ＩＰＥＣ－Ｊ２為試驗?zāi)Ｐ?，用丁酸梭菌分離株作用細胞后檢測其黏附能力。利用不同濃度的丁酸梭菌黏附細胞，檢測黏附數(shù)的變化。試驗結(jié)果表明，丁酸梭菌對腸上皮細胞具有較好的黏附性，結(jié)合丁酸梭菌對細胞生長狀況的影響及其黏附細胞的結(jié)果，最終確定丁酸梭菌的最佳ＭＯＩ為５０。本研究中發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌ＭＯＩ為１００時，會引起細胞損傷甚至死亡，并且丁酸梭菌的黏附數(shù)會下降，可能是因為丁酸梭菌產(chǎn)生丁酸等代謝產(chǎn)物使細胞培養(yǎng)液的ｐＨ降低，對細胞生長產(chǎn)生了不利影響。用丁酸梭菌的最佳感染濃度處理細胞，隨著作用時間的延長，丁酸梭菌黏附細胞的能力增加，但是其黏附數(shù)差異并不顯著，為縮短試驗周期，后續(xù)試驗選擇黏附的最適時長為３ｈ，當(dāng)作用時間為２４ｈ時，丁酸梭菌黏附能力下降，這可能是由于細胞培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)用盡，也可能是由于細胞表面的黏附受體有限，導(dǎo)致丁酸梭菌黏附數(shù)達到飽和導(dǎo)致黏附率下降，關(guān)于這一現(xiàn)象出現(xiàn)的原因目前在丁酸梭菌上研究較少，需要進一步研究。

梁東梅等研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌、唾液乳桿菌、嗜酸乳桿菌均在作用細胞２４ｈ時黏附能力開始下降，與本試驗結(jié)果一致。劉海鴻等研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌在作用２和４ｈ時黏附能力開始下降，本試驗結(jié)果與此不同。這種黏附效果和細胞生長狀況的差異可能是由于試驗菌株類型、使用菌株濃度及其代謝產(chǎn)物、使用細胞類型等不同造成的。丁酸梭菌抑制致病菌黏附結(jié)果表明，丁酸梭菌能夠顯著抑制致病菌黏附，這主要可能是由于丁酸梭菌競爭性黏附細胞以后占據(jù)了黏附位點，抑制致病菌與腸上皮細胞表面的受體結(jié)合。但是當(dāng)致病菌作用時間達到２４ｈ時，丁酸梭菌的抑制能力降低，這可能是由于致病菌釋放的內(nèi)毒素等有害物質(zhì)對細胞產(chǎn)生了毒性作用，影響了細胞及益生菌的正常生理功能。

３.３　丁酸梭菌對ＩＰＥＣ－Ｊ２免疫應(yīng)答的影響

丁酸梭菌作為飼料添加劑，可以通過激活機體的免疫應(yīng)答，增加免疫球蛋白ＩｇＡ和ＩｇＭ的含量，激活自然殺傷細胞和巨噬細胞，從而提高機體的免疫能力。炎癥細胞因子是一類可以調(diào)節(jié)機體炎癥反應(yīng)的多肽類物質(zhì)總稱。ＩＬ－８主要由單核－巨噬細胞產(chǎn)生，定向游走到反應(yīng)部位并釋放一系列活性產(chǎn)物，這些活性物質(zhì)導(dǎo)致機體局部的炎癥反應(yīng)，達到殺菌目的，但是釋放較多會引起細胞損傷。ＩＬ－１β促進Ｂ細胞增殖和分泌抗體，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，參與組織修復(fù)等。ＴＮＦ－α是機體重要的炎性因子，它的主要作用是調(diào)節(jié)免疫細胞的功能，殺傷腫瘤細胞，引起細胞凋亡和炎癥反應(yīng)，參與組織損傷修復(fù)等。本試驗結(jié)果表明，丁酸梭菌可以上調(diào)炎癥因子ＩＬ－８、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α基因的表達。楊靜試驗結(jié)果表明，隨著丁酸梭菌及磷壁酸處理濃度的增加，促炎因子ＩＬ－８的ｍＲＮＡ表達量增加，與本試驗結(jié)果相符。張傳健研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，丁酸梭菌組和抗生素組均能提高ＴＮＦ－α的含量，與本試驗結(jié)果一致。由此可見，丁酸梭菌對動物腸道免疫起到一定的刺激作用，這種微弱的刺激可引起適量炎癥細胞因子的產(chǎn)生，不會損傷腸上皮細胞的完整性，有利于增強腸道黏膜免疫防御功能，對動物腸道健康有一定的積極作用。

綜上所述，分離得到的丁酸梭菌培養(yǎng)上清能夠抑制產(chǎn)腸毒素大腸桿菌和沙門氏菌的生長，且丁酸梭菌對豬腸上皮細胞具有良好的黏附能力，能夠有效抑制產(chǎn)腸毒素大腸桿菌和沙門氏菌的黏附，為丁酸梭菌在仔豬日糧中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，并且探索出了丁酸梭菌作用細胞的合適濃度和時長，為深入研究丁酸梭菌調(diào)節(jié)仔豬腸道健康機理奠定了基礎(chǔ)。

４　結(jié)　論

本研究從健康斷奶仔豬糞便中成功分離到一株丁酸梭菌，該分離株能夠顯著抑制致病性大腸桿菌和沙門氏菌的生長，能夠黏附ＩＰＥＣ－Ｊ２且能抑制致病性大腸桿菌和沙門氏菌的黏附，上調(diào)炎癥因子的表達，激活ＩＰＥＣ－Ｊ２的免疫反應(yīng)，對動物腸道健康有一定的積極作用。

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一株丁酸梭菌的分離鑒定及其益生特性研究

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