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以玉米蛋白粉為主要原料生產(chǎn)發(fā)酵飼料菌種的研究

2018-06-05 14:30:28      點擊:


導讀

玉米蛋白粉也稱為玉米麩質粉,是加工玉米淀粉的副產(chǎn)物之一,主要成分為玉米醇溶蛋白和玉米黃色素(趙文揚等,2015),其中醇溶蛋白的含量可高達45%,而水溶性蛋白僅占3%左右,因而玉米蛋白粉水溶性特別差,且所含蛋白質缺少賴氨酸、色氨酸等必需氨基酸,所以其生物學價值低(Shukla,2001),將其用于飼料工業(yè),存在蛋白質消化利用率低的問題。采用微生物發(fā)酵的方法可提高玉米蛋白的可溶性,從而提高其作為飼料的動物消化利用率,促進玉米蛋白質資源的有效利用(王燕等,2014)。

生產(chǎn)微生物發(fā)酵飼料的首要問題是選擇合適的菌種。目前微生物發(fā)酵飼料最常使用的菌種為酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌、鏈球菌屬及部分霉菌等(劉艷新,2017)。本研究以發(fā)酵飼料中可溶性蛋白為指標,篩選出酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌的三菌組合用來生產(chǎn)玉米蛋白粉發(fā)酵飼料。


1材料與方法

1.1 主要材料及設備

菌種:熱帶假絲酵母、啤酒酵母、凝結芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜酸乳酸桿菌、嗜熱乳酸桿菌均由齊齊哈爾大學生物工程實驗室提供。

原料:玉米蛋白粉、麩皮均為市售。試劑:葡萄糖、胰蛋白胨、酵母浸出物、氯化鈉、牛肉膏、瓊脂、磷酸氫二鉀、檸檬酸二銨、醋酸鈉、吐溫80、七水合硫酸鎂、四水合硫酸錳、鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、三氯乙酸等均為國產(chǎn)分析純。

設備:電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠),PHS-25數(shù)顯pH計(上海精密科學儀器有限公司),超凈工作臺(上海智城分析儀器有限公司),BS224S型電子天平(北京塞多利斯儀器廠),手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠),紫外可見分光光度計(日本島津儀器廠)等。


1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制篩選

培養(yǎng)基:5g玉米蛋白粉、pH中性,2g瓊脂,定容至100mL,121℃蒸汽滅菌;發(fā)酵培養(yǎng)基:35g玉米蛋白粉、15g麩皮、50g水,pH中性,121℃蒸汽滅菌;PDA培養(yǎng)基:取約200g的馬鈴薯,去外皮后切成較碎小塊,煮沸約40min后進行過濾,將濾液配成1000mL的溶液,葡萄糖20g,pH自然,固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂;NA培養(yǎng)基:蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g、氯化鈉5.0g、蒸餾水1000mL,pH7.3,固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂;MRS乳酸細菌培養(yǎng)基:蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、檸檬酸氫二銨2.0g、葡萄糖20.0g、吐溫801.0mL、乙酸鈉5.0g、磷酸氫二鉀2.0g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g、瓊脂18.0g、蒸餾水1000mL,pH6.5,固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂。


1.2.2 菌種活化

在高壓蒸汽滅菌鍋內對已配制的培養(yǎng)基進行滅菌,分別將熱帶假絲酵母、啤酒酵母接種到PDA培養(yǎng)基,凝結芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌接種到NA培養(yǎng)基,嗜酸乳酸桿菌、嗜熱乳酸桿菌接種到MRS乳酸細菌培養(yǎng)基上,放入培養(yǎng)箱內30℃下培養(yǎng)48h備用。1.2.3平板培養(yǎng)首先確定菌種是否對玉米黃粉具有利用能力。將活化好的八株菌在篩選培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),每菌三個平行,在30℃恒溫條件下培養(yǎng)48h,觀察各菌種的生長情況。


1.2.4 發(fā)酵試驗

將能利用玉米蛋白粉的菌種活化后接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基上,置于30℃條件下發(fā)酵一定時間,測定其可溶性蛋白含量。


1.2.5 正交試驗

以篩選出的三種菌株另加一空列為因素,接種量為水平,設計四因素三水平(L934)的正交試驗。三種菌株分別活化后,按一定比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃發(fā)酵144h,根據(jù)所測定的發(fā)酵玉米蛋白粉飼料中可溶性蛋白含量,對配合菌株的接種比例進行確定。


1.2.6 主要測定方法

可溶性蛋白含量的測定采用福林酚法(王永華,2010)。

2結果與討論

2.1 菌種利用玉米蛋白粉能力測定

將待選的八種菌株分別在含有5%玉米蛋白粉的篩選固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),根據(jù)其生長狀況確定其對玉米蛋白粉的利用能力。結果表明,本研究所采用發(fā)酵飼料常用的八種菌種在篩選培養(yǎng)基上均長勢良好,說明都具有較強的利用玉米蛋白粉的能力,故這八種待選菌株均可作為發(fā)酵玉米蛋白粉發(fā)酵菌種。


2.2 發(fā)酵用配合菌株的選擇

由于所選用的八種菌株均能利用玉米蛋白粉, 故都用于發(fā)酵用配合菌株的篩選。將其分別活化后,以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)。每24 h 取樣測定其中的可溶性蛋白含量,以確定各種菌株發(fā)酵玉米蛋白粉的能力。結果見表1。


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據(jù)表1 可以看出, 所選用的八種菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基后,隨著時間的延長,發(fā)酵飼料中的可溶性蛋白含量均逐步提高。其中芽孢桿菌中枯草芽孢桿菌發(fā)酵的效果最好, 在144 h 時可溶性蛋白含量為10.44%;酵母菌中熱帶假絲酵母菌發(fā)酵的結果較好,在144 h 時可溶性蛋白含量為9.48%;乳酸桿菌中嗜熱乳酸桿菌發(fā)酵的結果最好,在144 h 時可溶性蛋白含量為9.04%。

目前微生物發(fā)酵飼料最常使用的菌種為酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌、鏈球菌屬及部分霉菌等,飼料酵母可產(chǎn)多種動物所需的消化酶, 對營養(yǎng)物質的消化吸收起著重要作用, 同時酵母菌具有濃烈的酵母香味,對家畜增加食欲、增強消化吸收等有一定作用(Puniya,2015);芽孢桿菌具有較強的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活性,可明顯提高飼料利用率,還可以消耗大量的氧氣,維持腸道厭氧環(huán)境,抑制致病菌的生長,維持腸道正常生態(tài)平衡,增強機體免疫力(李春鳳,2013);乳酸菌可以提高飼料的品質,并能直接促進動物生長,改善消化道微生態(tài)環(huán)境,調節(jié)消化道免疫系統(tǒng),具有替代含抗生素飼料的潛能(王芳芳,2016)。每種菌在發(fā)酵飼料中都有不同的功效, 因此混合發(fā)酵效果要優(yōu)于單菌發(fā)酵。

綜上所述,選擇枯草芽孢桿菌、熱帶假絲酵母和嗜熱乳酸桿菌做為發(fā)酵玉米蛋白粉飼料的配合菌株。


2.3 配合菌株比例的確定

將所選出的三種配合菌株進行正交試驗,以確定菌種的最佳比例。結果見表2。

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由表2 分析可知,RB>RC>RA,即因素的主次順序依次為枯草芽孢桿菌(因素B),熱帶假絲酵母菌(因素C),嗜熱乳酸桿菌(因素A);各因素水平的比較:KB3>KB2>KB1,KC2>KC1>KC3,KA3>KA1>KA2,由此得出利用枯草芽孢桿菌、熱帶假絲酵母和嗜熱乳酸桿菌發(fā)酵玉米蛋白粉飼料的最佳接種比例組合為A3B3C2,即嗜熱乳酸桿菌:枯草芽孢桿菌:熱帶假絲酵母菌=3∶3∶2,通過驗證試驗,在此接種比例下,發(fā)酵玉米蛋白粉中可溶性蛋白含量達到最高為14.47%,較發(fā)酵之前的3.04%提高了11.43%。


3結 論

通過平板培養(yǎng)和發(fā)酵試驗相結合的方法,篩選出以玉米蛋白粉為主要原料生產(chǎn)發(fā)酵飼料的菌種為嗜熱乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌和熱帶假絲酵母; 利用正交試驗確定所用三種菌株的比例為嗜熱乳酸桿菌:枯草芽孢桿菌:熱帶假絲酵母=3∶3∶2。


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