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我國(guó)紅棗產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的98％ ，產(chǎn)地廣泛分布于山西、陜西、寧夏、河北、新疆等地 。紅棗發(fā)酵酒是一種低酒精度、高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的滋補(bǔ)飲品，以紅棗為原料，經(jīng)過篩選、破碎、低溫發(fā)酵、陳釀、調(diào)制等工藝釀制而成 。棗渣是棗酒、棗汁生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的含有水、細(xì)胞碎片和豐富膳食纖維的副產(chǎn)物 。近年來(lái)，利用廢棄物進(jìn)行發(fā)酵來(lái)增加產(chǎn)品附加值已成為研究的熱點(diǎn)，如利用廢渣或廢棄木質(zhì)纖維素等。關(guān)于廢渣的研究，如對(duì)葡萄渣、刺梨果渣、馬鈴薯渣和柑橘皮渣的利用研究已有了一定的進(jìn)展，但對(duì)棗渣的綜合利用的研究報(bào)道甚少 。酵母菌和乳酸菌作為益生菌不僅廣泛應(yīng)用于單純發(fā)酵，還應(yīng)用于以上各類廢渣的發(fā)酵中。侯蓓等使用棗渣為原料培養(yǎng)嗜酸乳桿菌，尋求嗜酸乳桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)配方。乳酸菌和酵母菌作為常見發(fā)酵菌種，它們之間存在著穩(wěn)定的共生關(guān)系，這種可靠的關(guān)系使得微生物對(duì)于復(fù)雜的食品系統(tǒng)具有更高的適應(yīng)性。乳酸桿菌在發(fā)酵中起到產(chǎn)酸的作用，抑制雜菌生長(zhǎng)的同時(shí)還能有效改善飼料的適口性。釀酒酵母在發(fā)酵過程中可以利用底物的營(yíng)養(yǎng)成分短時(shí)間內(nèi)合成菌體蛋白。因此，利用這兩種菌種混合發(fā)酵既能夠發(fā)揮乳酸菌的益生和抑菌的作用，還可以生產(chǎn)相應(yīng)優(yōu)質(zhì)蛋白。

筆者使用嗜酸乳酸桿菌和釀酒酵母菌作為發(fā)酵菌種，對(duì)棗渣進(jìn)行發(fā)酵研究。對(duì)培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高單細(xì)胞蛋白含量，從而提高棗渣資源化利用價(jià)值，拓寬飼料原料來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 材 料

１.１.１ 菌 種

嗜酸乳桿菌（ Lactobacillus acidophilus ）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）為試驗(yàn)室自有菌種。

１.１.２ 原料與試劑

棗渣，由寧夏某紅棗酒業(yè)生物科技有限公司負(fù)責(zé)提供；玉米、麩皮均為公司正常批次采購(gòu)；硫酸銨、碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀為分析純級(jí)別試劑。

1.2 試驗(yàn)方法

１.２.１ 發(fā)酵工藝及控制點(diǎn)

１） 主要原料處理：將除去核的棗渣在50℃下烘干48h ，粉碎，以m（棗渣） ∶ m（玉米）：原料處理：將輔助原料以m（硫酸銨）：m（硫酸鎂）：m（磷酸二氫鉀） ∶ m（碳酸鈣）＝ １： 0.5：１：0.5的比例混合均勻，溶于100g 純化水中備用。
３） 發(fā)酵培養(yǎng)基配制：將主要原料和輔助原料以m（主要原料）：m（輔助原料） ＝ １ ∶ １ 的比例混合均勻，116 ℃ 滅菌15 min ，冷卻備用。

４） 活化接種：將嗜酸乳酸桿菌和釀酒酵母菌進(jìn)行傳代活化，至少傳代3代，將兩種菌液按m（釀酒酵母）：m（嗜酸乳酸桿菌）=２：１ 比例混合，再按每100 g 培養(yǎng)基接種15mL 活化菌液的比例接入菌液。最后稱取100g 培養(yǎng)基裝入500 mL 三角瓶中，充分混合均勻。

５） 發(fā)酵培養(yǎng)條件：在32 ℃ 恒溫的條件下，進(jìn)行普通有氧發(fā)酵84h ，每隔12 h 翻動(dòng)一次。

６） 發(fā)酵產(chǎn)物處理：在45 ℃ 恒溫條件下，將發(fā)酵產(chǎn)物烘干至恒重，將烘干后的樣品用粉碎機(jī)粉碎后過40目篩。

１.２.２ 棗渣培養(yǎng)基主要成分分析

研究所用棗渣，屬于釀酒發(fā)酵后的剩余物，營(yíng)養(yǎng)成分較低。為充分滿足微生物生長(zhǎng)需求，培養(yǎng)基中必須添加適量的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子和水。因此，對(duì)棗渣培養(yǎng)基中的主要原材料進(jìn)行水分、粗蛋白和總糖進(jìn)行檢測(cè)分析，以確定添加比例。

１.２.３ 菌種考察試驗(yàn)

１） 混菌比例試驗(yàn)

嗜酸乳酸桿菌和釀酒酵母的混合比例會(huì)影響到發(fā)酵的產(chǎn)物形成，需對(duì)其最適配比進(jìn)行試驗(yàn)考察，所使用的培養(yǎng)基中各成分為m（棗渣）：m（玉米）：m（麩皮）：m（硫酸銨）：m（碳酸鈣）：m（硫酸鎂）：m（磷酸二氫鉀） ＝50：20：30：1.0：0.6：0.4：1.5 。混菌配比見表１ 。

１～５ 號(hào)培養(yǎng)基按10％的接種量進(jìn)行接種，絕對(duì)接種量為3×107cfu／mL，６號(hào)培養(yǎng)基接種量為0，每組３ 個(gè)平行，在發(fā)酵條件下培養(yǎng)并進(jìn)行處理，檢測(cè)真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

２） 接種量試驗(yàn)

以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％，10％，15％，20％ 和25％ 的混菌接種量，分別接種至配制好的培養(yǎng)基中，每組３個(gè)平行，培養(yǎng)溫度32 ℃ ，恒溫培養(yǎng)時(shí)間84 h ，對(duì)其真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行檢測(cè)。

１.２.４ 培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

采用正交試驗(yàn)，對(duì)培養(yǎng)基中4種無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行考察，以發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為判斷依據(jù),以確定最適合的培養(yǎng)基配方。

１.２.５ 相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)方法

試驗(yàn)中的粗蛋白的測(cè)定采用凱氏定氮法；水分檢測(cè)采用烘箱法；總糖的測(cè)定采用DNS 法；真蛋白的測(cè)定采用硫酸銅沉淀法。

2 結(jié)果與分析

2.1棗渣培養(yǎng)基主要成分分析結(jié)果

棗渣培養(yǎng)基各主要成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表2。

由表２可知：棗渣中含有未被利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)低是由于制酒過程中會(huì)消耗大量的糖和蛋白質(zhì)，致使棗渣中的糖和蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏低，適當(dāng)添加其他輔料可有效補(bǔ)充不足。添加玉米和麩皮能有效提高可利用糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.2 菌種考察試驗(yàn)

２.２.１ 混菌比例試驗(yàn)

混菌比例對(duì)真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響見圖１ 。

Fig.1 Effect of mixed bacteria ratio on true protein content

由圖１ 可看出：隨著釀酒酵母配比的提高，真蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯提高，５ 號(hào)配比中，當(dāng)m（釀酒酵母）: m（嗜酸乳酸桿菌）= ２:１ 時(shí)，產(chǎn)物中的真蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到15.45％ ;４ 號(hào)培養(yǎng)基中當(dāng)m（釀酒酵母）:m（嗜酸乳酸桿菌）= ２:１時(shí)，產(chǎn)物中真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)也達(dá)到15.13％ 。試驗(yàn)結(jié)果表明：釀酒酵母才是影響真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的主要因素，而嗜酸乳酸桿菌的影響較小，釀酒酵母與嗜酸乳桿菌的最佳混菌質(zhì)量比例為m（釀酒酵母）:m（嗜酸乳酸桿菌）=２ :１ 。

２.２.２ 接種量對(duì)真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響
接種量對(duì)真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響見圖２ 

Fig .2 Effect of inoculum size on true protein content

由圖２ 可看出：在一定范圍內(nèi)，接種量與真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)成正比，當(dāng)接種量達(dá)到20％ 時(shí)，真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢(shì)，這可能是由于接種量過高，菌種生長(zhǎng)較快，出現(xiàn)了抑制作用。當(dāng)混菌接種量為15％時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)到15.58％ 。試驗(yàn)結(jié)果表明：在相同條件下，最適的混菌接種量為15％ 。

2 .3 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)

在最適混菌比例和接種量條件下，對(duì)硫酸銨、碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀4個(gè)影響因素進(jìn)行正交試驗(yàn)驗(yàn)證，培養(yǎng)基配方因素水平見表3，正交試驗(yàn)結(jié)果見表4，正交試驗(yàn)方差分析見表5。

表3 培養(yǎng)基配方L16 4⁵正交試驗(yàn)因素水平表

Table 3 Medium formula L16  4⁵orthogonal test factor level table

表4 培養(yǎng)基配方L16 4⁵正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

Table 4 Medium formulation L16 4⁵orthogonal test protocol and results

表5 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)方差分析表

Table 5 Medium optimization orthogonal test variance analysis

表3中的K 值是同一因素某一水平試驗(yàn)條件下，真蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測(cè)結(jié)果平均值，其下標(biāo)為對(duì)應(yīng)的水平代碼。R 表示同一因素不同水平試驗(yàn)條件下，真蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測(cè)結(jié)果的極差，其值代表著某一因素對(duì)真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加的影響程度。S 值表示同一因素的偏差平方和，對(duì)其進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，得到F值。查F 分布數(shù)值表得到Fa值，通過比較F 與Fa 值大小，以確定各因素的顯著性。

由表４,５ 可以看出：硫酸銨影響最顯著，主次因素順序?yàn)榱蛩徜@＞ 磷酸二氫鉀＞ 硫酸鎂＞ 碳酸鈣。由表４ 中的K 值，可以比較出同一因素不同水平對(duì)真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的程度，從而得出最優(yōu)組合為A２B３C４D３。由于最優(yōu)配方組合沒有含在表３的16組試驗(yàn)中，另外進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果真蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.１％ ，高于表３ 中最佳組合A２B３C４D2的結(jié)果。

2 .4 發(fā)酵前后棗渣蛋白質(zhì)含量變化情況

綜上所述，使用最適培養(yǎng)基配方，其各組分的質(zhì)量比為：m（棗渣）: m（玉米）:，m（麩皮）:m（硫酸銨）:m（碳酸鈣）:m（硫酸鎂）:m（磷酸二氫鉀）=50∶20∶30∶1.0∶ 0.6: 0.4∶1.5；在培養(yǎng)溫度為32 ℃ 的條件下發(fā)酵84h ，發(fā)酵前后的真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測(cè)結(jié)果見表6。

表6 發(fā)酵前后棗渣真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)

Table 6 True protein content of jujube residuebefore and after fermentation

由表６ 可知：使用釀酒酵母和嗜酸乳桿菌混合菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵棗渣，產(chǎn)物真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化比較明顯，發(fā)酵后比發(fā)酵前提高了5.38％ 。

3 結(jié) 論

筆者采用固體發(fā)酵技術(shù)，利用釀酒酵母和嗜酸乳桿菌對(duì)棗渣進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，試驗(yàn)最終確定了最佳發(fā)酵工藝為m（釀酒酵母）∶m（嗜酸乳酸桿菌）=２:１,活化菌液的接種量為15％ ，培養(yǎng)基各成分最佳質(zhì)量配比為m（棗渣）:m（玉米）:m（麩皮）:m（硫酸銨）:m（碳酸鈣） ∶ m（硫酸鎂）:m（磷酸二氫鉀）=50∶20∶30∶1.0 ∶0.6∶ 0.4∶1.5。在32℃ 的恒溫培養(yǎng)條件下，發(fā)酵84 h 后，發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.1％ ，比發(fā)酵前提高了5.38％ 。利用釀酒酵母和嗜酸乳桿菌對(duì)廢棄棗渣進(jìn)行生物發(fā)酵處理，明顯的提高了廢棄棗渣的飼用價(jià)值。

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