摘要：研究旨在優(yōu)化淀粉酶、糖化酶和酵母菌固體發(fā)酵玉米蛋白粉的條件，以期提高玉米蛋白粉中粗蛋白質的含量。通過單因素及正交試驗，以粗蛋白質含量為指標，確定了玉米蛋白粉的最佳發(fā)酵條件。其最適條件為：淀粉酶0.20%、糖化酶0.30%、酵母菌粉0.30%、比例1:0.6，發(fā)酵溫度35.0℃，初始pH值5.0~6.0，料層厚度4~6cm，好氧發(fā)酵24h后，產(chǎn)物中粗蛋白質含量可達72.35%，提高了20.04%，發(fā)酵后的總必需氨基酸和總氨基酸分別增加了20.43%、18.88%。

玉米蛋白粉是由玉米粒經(jīng)濕磨法工藝制得的粗淀粉乳，再經(jīng)淀粉分離機分離出的蛋白質水，然后用離心機或氣浮懸法濃縮、脫水干燥制得。其蛋白質含量在60%以上，其余約為20%的淀粉和13%的纖維素及少量酯類、玉米黃素、葉黃素等。玉米蛋白質中主要是醇溶蛋白，其含量約占玉米總蛋白的68%，另外還含有22%的谷蛋白及少量球蛋白、白蛋白。

目前國內外學者對玉米蛋白粉的研究多采用酶解法、微生物發(fā)酵法或菌酶協(xié)同作用法等，以期提高原料中的可吸收性小肽、可溶性蛋白或粗蛋白質的含量，與其他飼料原料搭配飼用，可達到良好的效果。胡海濱等研究了在飼料中添加發(fā)酵玉米蛋白粉替代部分魚粉對卵形鯧鲹生長性能的影響，結果表明，在復合飼料中添加11.8%~17.3%的玉米蛋白粉能夠改善卵形鯧鲹的生長性能和飼料利用能力。何嬌嬌等研究了發(fā)酵玉米蛋白粉替代魚粉對大黃魚生長、腸道組織結構及腸道微生物菌群的影響，結果表明，大黃魚幼魚飼料中可以使用玉米蛋白粉來替代45%的魚粉，既不影響大黃魚幼魚的生長和存活，也不影響其腸道組織結構及優(yōu)勢菌群變化。苗國偉對玉米蛋白粉進行了混菌固體發(fā)酵的工藝研究，發(fā)酵結束后，粗蛋白質含量提高了7.33%，并在肉雞日糧中添加了該發(fā)酵玉米蛋白粉，研究結果表明，肉雞平均采食量有所提高，料重比顯著降低，試驗組腸道內大腸桿菌數(shù)量顯著減少，乳酸桿菌數(shù)量顯著提高，并且明顯增強了肉雞血清對羥自由基（·OH）和超氧自由基（O₂-·）的清除能力。

玉米蛋白粉中存在著部分碳水化合物，如淀粉，不能被動物直接吸收利用，因此限制了其在高品質飼料中的應用。為提高玉米蛋白粉的綜合利用效率，利用微生物學方法，去除原料中的碳水化合物，從而增加其發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質的含量，使之成為一種優(yōu)質的植物蛋白資源，在本研究中，采用“復合酶+酵母菌”的方式對玉米蛋白粉進行了固體好氧發(fā)酵，并取得了良好的效果，為玉米蛋白粉在畜禽、水產(chǎn)飼料方面的合理、有效利用提供了一種參考方法。

1、材料與方法

1.1試驗材料

飼料用酵母菌粉，活菌數(shù)2×101⁰cfu/g。

淀粉酶、糖化酶。

玉米蛋白粉（粗蛋白含量60.27%）。

1.2試驗設計

試驗包括8個單因素試驗和1個正交試驗，分別篩選料水比例（1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8）、淀粉酶添加量（0、0.20%、0.40%、0.60%、0.80%）、糖化酶添加量（0、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%）、酵母菌粉添加量（0、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%）、培養(yǎng)溫度（25、30、35、40℃）、培養(yǎng)時間（8、16、24、32、40h）、初始pH值（pH值自然，pH值4.0、5.0、6.0、7.0）、料層厚度（2、4、6、8、10cm），每個因素水平設置3個重復。對于影響結果顯著的淀粉酶、糖化酶粉、酵母菌粉和料水比例再進行四因素三水平L9（34）的正交試驗。

1.3試驗方法

1.3.1單因素試驗

玉米蛋白粉原料200.0g，加入0.40%（與原料的比值，下同）的淀粉酶，0.20%糖化酶，0.20%酵母菌粉，料水比例1:0.7，酶、菌分別溶于水中，攪拌均勻后，同時加入物料中，調整原料起始pH值至5.0~6.0，再將混合均勻的發(fā)酵料轉移至鋪有8層無菌紗布的塑料筐內，堆積高度為4~6cm，在表層覆蓋8層無菌紗布，確保四周覆蓋嚴實后，置于恒溫箱內培養(yǎng)，設置發(fā)酵溫度為35℃，發(fā)酵時間24h。

在上述各單因素恒定的基礎上，對需研究的因素按設計進行調整。

1.3.2正交試驗

在1.3.1得到的各單因素試驗結果中，利用SPSS25.0軟件對各單因素試驗結果進行顯著性分析，得到淀粉酶、糖化酶、酵母菌粉和料水比例四個因素對結果的影響較為顯著。由此，設置了四因素三水平L9（34）的正交試驗（見表1）

1.4測定指標及方法

將發(fā)酵樣品在80℃下烘干，粉碎后測定含水量、粗蛋白質，以干物質計粗蛋白質含量。將玉米蛋白粉原料和在最適發(fā)酵條件下得到的樣品分別進行氨基酸含量的測定。粗蛋白質含量按照GB/T5009.5-2010的方法進行測定；含水量按照GB/T5009.3—2016的方法測定；氨基酸含量按照GB/T18246-2000的方法測定。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用EXCEL2016進行初步處理后，采用SPSS25.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，檢驗組間差異顯著性，用Duncan's法進行多重比較，結果以“平均值±標準差”表示，顯著性水平為0.05。

2、結果與討論

2.1單因素試驗結果

2.1.1料水比例(見表2)

水分過低，營養(yǎng)物溶解性減少，底物顆粒膨脹程度低；水分過高，則通透性差，限制氣體和熱量的傳遞。玉米蛋白粉吸水性能強，若水分過少，則原料不能充分吸水膨脹，影響發(fā)酵效果；水分過高，原料易出現(xiàn)成團現(xiàn)象，導致氣體難以均衡分布，不能實現(xiàn)均勻發(fā)酵，且烘干過程必將增加能耗。由表2及結合產(chǎn)物粗蛋白質含量及實際需求考慮，料水比例宜選擇為1:0.6。

2.1.2淀粉酶添加量(見表3)

利用淀粉酶對淀粉進行酶解處理，能夠充分地去除玉米蛋白粉中殘留的淀粉。由表3可知，添加量為0~0.40%時，粗蛋白質的含量與淀粉酶添加量成正比關系，表明淀粉酶降解了原料中的部分淀粉，使之轉變?yōu)榻湍缚衫玫奶窃镔|，隨著淀粉被消耗，粗蛋白質的含量逐步得到提高。當添加量為0.40%時，繼續(xù)添加淀粉酶，粗蛋白質的含量趨于穩(wěn)定。故宜選擇淀粉酶的添加量為0.40%。

2.1.3糖化酶添加量(見表4)

糖化酶能從淀粉分子的非還原性末端水解α-1，4葡萄糖苷鍵，生成葡萄糖，供酵母生長、代謝利用。其與淀粉酶配合使用，能夠徹底降解原料中殘留的淀粉，從而使粗蛋白質的含量得到進一步的濃縮。由表4可知，糖化酶的添加量宜為0.20%。

2.1.4酵母菌粉添加量(見表5)

發(fā)酵料中加入酵母菌粉后，除可利用基質大量合成自身所需要的菌體蛋白和細胞骨架，從而提高飼料中蛋白質含量外，同時還可消耗一定量的糖類物質，釋放出能量和二氧化碳，糖類物質比例降低后，導致了基質中蛋白質的單位含量的增加。在本研究中，玉米蛋白粉未經(jīng)高溫處理，整個發(fā)酵過程中原料均以生料狀態(tài)存在，有研究表明玉米蛋白粉生料可經(jīng)酵母的代謝作用產(chǎn)生酒精。加入的酵母菌能夠利用酶解產(chǎn)生的糖類物質，除生成酒精外，還能夠代謝產(chǎn)生芳香類物質。發(fā)酵后的玉米蛋白粉具有濃烈的酵母香味，對畜禽增加食欲，增強消化吸收等有一定作用。由表5結果可知，酵母菌粉的添加量宜選擇0.20%。

2.1.5培養(yǎng)溫度(見表6)

溫度是影響發(fā)酵成敗的一個重要因素，在適宜的溫度下，菌株生長代謝活動旺盛，且酶能夠發(fā)揮正常功效。如表6所示，25~35℃的溫度范圍內，產(chǎn)物中粗蛋白質的含量隨著溫度的上升呈緩慢增長趨勢。培養(yǎng)溫度高于35℃后，粗蛋白質含量略有下降，故培養(yǎng)溫度選擇35℃左右為宜。

2.1.6培養(yǎng)時間(見表7)

由表7可知，固體好氧發(fā)酵初期，粗蛋白質含量增加緩慢，當發(fā)酵進行到第24h時，延長發(fā)酵時間，粗蛋白質含量趨于穩(wěn)定。綜合考慮，發(fā)酵時間宜選擇24h。

2.1.7初始pH值(見表8)

玉米蛋白粉原料呈酸性，pH值在3.5~3.8之間。由表8可知，當初始pH值為5.0~6.0時，得到的產(chǎn)物粗蛋白質含量最高。原因在于，偏酸性環(huán)境下，有利于酵母菌的生長代謝及酶發(fā)揮自身活性。故在發(fā)酵前，應將玉米蛋白粉原料的初始pH值調至5.0~6.0。

2.1.8料層厚度(見表9)

料層的厚度影響著發(fā)酵料的氣體和熱量交換，料層較薄時，表層水分易散失，外層的物料難發(fā)酵透徹；料層較厚時，發(fā)酵料中心由于微生物呼吸產(chǎn)熱，不能及時散發(fā)出去，易形成內部溫度高于設定的培養(yǎng)溫度的情況，進而對發(fā)酵結果產(chǎn)生不良的影響。物料厚度低于4cm時，表層物料水分有所散失，有效發(fā)酵物料質量偏少，故得到的粗蛋白質含量低；當料層厚度超過6cm后，由于物料中心溫度較高，不適合酵母菌的生長代謝，故發(fā)酵能力低。由表9可知，在實驗室研究階段，玉米蛋白粉的厚度選擇4~6cm為宜。在大規(guī)模生產(chǎn)中，玉米蛋白粉堆積較厚時，可通過適時翻料，確保內外部氣體和熱量的流通，避免“燒心”現(xiàn)象，實現(xiàn)均勻發(fā)酵。

2.2正交試驗結果(見表10~表11)

由表10可知，經(jīng)過正交表極差分析，各發(fā)酵因素對發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質含量的影響主次順序為B>AC>D，即糖化酶>淀粉酶>酵母菌>料水比例。進一步的方差分析結果由表11可知，四個發(fā)酵因素對發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質的含量沒有顯著影響（P>0.05）。因此，本次試驗中淀粉酶、糖化酶、酵母菌粉和料水比例的最佳組合為A1B3C3D1，即淀粉酶添加量0.20%、糖化酶添加量0.30%、酵母菌粉添加量0.30%、料水比例1:0.6，按照該最佳組合進行多次重復試驗，得到的發(fā)酵產(chǎn)物中，粗蛋白質的平均含量為72.35%，高于正交試驗中的最佳結果，可作為玉米蛋白粉發(fā)酵的最適條件。

2.3發(fā)酵前后氨基酸含量的變化

比較玉米蛋白粉原料和經(jīng)最適發(fā)酵條件得到的產(chǎn)物中的氨基酸種類及含量，如表12所示，發(fā)酵后的總必需氨基酸和總氨基酸分別增加了20.43%、18.88%。在菌酶協(xié)同作用的發(fā)酵結果中，必需氨基酸中的賴氨酸和纈氨酸含量增加比例較大，分別比發(fā)酵前增加了31.30%、28.19%；非必需氨基酸中的組氨酸和絲氨酸分別比發(fā)酵前增加了27.13%、23.62%。

3、討論

玉米蛋白粉來源豐富、價格低廉，蛋白質含量高，可達60%以上，但蛋白中醇溶蛋白比高，蛋白質水溶性差、氨基酸組成不平衡。目前對玉米蛋白粉的研究中，主要是利用單一菌種或復合菌種來進行固體發(fā)酵。采用羊肚菌對玉米蛋白粉進行固體發(fā)酵培養(yǎng)，含水量65%、接種量14%、培養(yǎng)溫度25℃、初始pH值6.0、發(fā)酵時間20d，得到蛋白轉化率為22.36%，發(fā)酵后親水性氨基酸提高了12.75%。選用地衣芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌和黑曲霉為復合菌，接種量分別為4%、4%、6%、6%，發(fā)酵溫度35℃、發(fā)酵時間84h、含水量45%、初始pH值6.0，發(fā)酵后，多肽得率為44.03%，粗蛋白質含量提高了15.17%，總必需氨基酸和總氨基酸含量分別增加了12.58%和12.37%。菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料是以國家相關法規(guī)允許的飼料原料、酶制劑和微生物，通過發(fā)酵工程和酶工程技術協(xié)同作用生產(chǎn)的單一飼料和混合飼料。玉米蛋白粉中含有15%~21%的淀粉，通過微生物與復合酶的協(xié)同作用，進行一系列的降解與轉化，最終可達到蛋白濃縮的目的。本試驗中，采用酵母菌、淀粉酶和糖化酶混合的協(xié)同方式，使玉米蛋白粉中粗蛋白質含量達到72.35%，在原料的基礎上提高了20.04%，高于目前所見固體發(fā)酵中相關文獻的報道值。在液體發(fā)酵中，雖有粗蛋白質含量高達74.47%的報道，如采用液體發(fā)酵的方式處理玉米蛋白粉，玉米蛋白粉4%，pH值6.0，接種量3%，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵72h后，蛋白水解度為16.72%，粗蛋白質含量74.47%，但使用液體發(fā)酵法處理玉米蛋白粉，受烘干成本高及利潤相對較低等因素制約，并不適用于在中小飼料企業(yè)推廣。

目前玉米蛋白粉產(chǎn)品仍存在著醇溶蛋白含量較高、可被動物直接吸收利用的小肽含量相對較低等問題，如何降解玉米蛋白粉中的醇溶蛋白、提高可吸收小肽含量以及驗證發(fā)酵后的產(chǎn)物在畜禽、水產(chǎn)方面的飼用效果，將作為下一步的研究重點。

4、結論

經(jīng)過單因素和正交試驗，得到了玉米蛋白粉的最適發(fā)酵條件為：淀粉酶0.20%、糖化酶0.30%，酵母菌粉0.30%、料水比例1:0.6，初始pH值5.0~6.0、發(fā)酵溫度35℃，料層厚度為4~6cm，好氧發(fā)酵24h。在該條件下得到的發(fā)酵產(chǎn)物中，粗蛋白質含量從60.27%提升至72.35%，提高了20.04%，且發(fā)酵后的總必需氨基酸和總氨基酸分別增加了20.43%、18.88%。

本產(chǎn)品是一種以高濃度乳酸菌和酵母菌等組合酶菌結合的復合專業(yè)飼料發(fā)酵劑產(chǎn)品，可以發(fā)酵我們常見的大部分飼料原料、農(nóng)家飼料、農(nóng)產(chǎn)品與食品加工下腳料，制作活性EM菌液與制作青貯飼料，具有發(fā)酵、除霉、降解纖維、提高發(fā)酵飼料營養(yǎng)與適口性且能夠長時間保存等功能，具有操作簡單成功率高、成本低廉等特點。

活力99增香增甜飼料發(fā)酵劑，高濃度乳酸菌、酵母菌專業(yè)酶菌結合飼料發(fā)酵劑，多功能飼料發(fā)酵劑，青貯飼料發(fā)酵劑_生態(tài)養(yǎng)殖環(huán)境治理_生態(tài)產(chǎn)品_高效生態(tài)養(yǎng)殖技術網(wǎng) (fjc001.com)

本產(chǎn)品符合飼料衛(wèi)生標準

【生產(chǎn)許可證號】桂飼添（2021）H01001

【產(chǎn)品執(zhí)行標準】Q/NNWR 02-2021（飼用復合微生物添加劑Ⅰ）

【適用對象】畜禽、水產(chǎn)、環(huán)保

【原料組成】酵母菌、芽孢桿菌、乳酸菌等，復合酶制劑與載體等。

【產(chǎn)品成分分析保證值】酵母菌、芽孢桿菌、乳酸菌等合計≥100億cfu/g，水分＜9.0%。

凈重：200 克/袋。

本產(chǎn)品是在活力99生酵劑的基礎上的升級產(chǎn)品，升級了増香增甜等功能效果。

鑒別本產(chǎn)品真假與效果的簡單方法：500毫升左右的礦泉水瓶子中放入約50克大米+300毫升35℃左右的溫水，加入本產(chǎn)品5克，幾個小時就會產(chǎn)生大量香醇氣體，72小時內大米基本溶解為乳狀。做試驗時請切記要注意礦泉水瓶炸開的安全。

產(chǎn)品使用說明書

（一）制作加強型活性EM菌液

在非金屬容器中將本品1包（200克）與1公斤紅糖（也可以用5公斤大米或玉米等含淀粉類的飼料代替）放入約50公斤溫水中，簡單密封48小時后就變成了加強型活性EM菌液（每毫升活菌在100億左右）。其使用方法如下：

1.在畜禽上的使用方法：根據(jù)不同動物與飼養(yǎng)周期按其飼料重量的0.1%-0.5%拌入飼料或飲水中后飼喂或飲用。

2.養(yǎng)殖場緊急除臭生物消毒：取加強型活性EM菌液兌水30倍清水，對產(chǎn)生臭味與異味的養(yǎng)殖區(qū)域、糞污水道、糞堆、污水池進行噴灑，以噴灑表面濕潤為準，接待參觀前1-3小時補噴一次效果更好。

3.制作青貯飼料：每噸青貯飼料中加入10公斤加強型活性EM菌液，簡單噴灑在料上壓實密封發(fā)酵15天以上。

4.養(yǎng)殖水產(chǎn)上的使用：每畝使用5公斤加強型活性EM菌液進行噴灑，晴天進行噴灑后注意增氧。

（二）制作各種發(fā)酵飼料

本品能夠發(fā)酵木薯渣、豆渣、米粉面條加工下腳料、剩菜剩飯、米糠、統(tǒng)糠、菌糠、酒糟、果渣果皮、青黃秸稈、牧草、紅薯藤、輕度霉變飼料等各種廉價飼料（下腳料）、各種飼料原料與全價飼料等，每500公斤待發(fā)酵原料加入本品1-2包（或50公斤上述加強型活性EM菌液）、20公斤以上的玉米粉或其它含淀粉類的飼料原料、1公斤食鹽（含有足夠食鹽的原料就不添加），含水量調節(jié)到約60%，壓實密封發(fā)酵2-7天左右有濃郁香味時即可使用。發(fā)酵后飼料的適口性、營養(yǎng)、消化率較未發(fā)酵前有明顯提升。發(fā)酵后的飼料根據(jù)不同動物與不同飼養(yǎng)周期按照10%-50%與該動物其它全價飼料混合后飼喂（先少量飼喂適應后逐漸增加的原則），不可以單獨飼喂或全部飼喂發(fā)酵飼料。

（三）發(fā)酵水產(chǎn)動物飼料成高濃度乳酸菌保健品

①部分發(fā)酵飼料運用：100公斤水產(chǎn)飼料、50公斤清水、本品1包密封發(fā)酵7天以上變成高濃度乳酸菌發(fā)酵飼料，以10%比例與水產(chǎn)動物飼料混合后飼喂，或者發(fā)酵飼料單獨飼喂；②全部發(fā)酵飼料飼喂：也叫輕度發(fā)酵飼料技術，300公斤水產(chǎn)全價飼料、本品1包、水120公斤混合發(fā)酵24小時全部飼喂，這種預消化結合大量乳酸菌飼喂能夠顯著改善水產(chǎn)動物腸道健康、水質改善等優(yōu)點。

（四）發(fā)酵部分禽糞做飼料

發(fā)酵雞糞（鴿子糞、兔糞等）作豬、魚等動物飼料，本品2包、100公斤玉米粉其它含淀粉類的飼料原料、500公斤雞糞，加入適量麥麩或米糠調節(jié)含水量約為55%-60%，覆蓋薄膜進行發(fā)酵，一周左右有濃郁香味時即可使用，可代替飼料20%左右，用于喂豬或魚類等。

（五）發(fā)酵菜粕、棉粕、花生餅、茶枯脫毒

原料1000公斤，玉米面其它含淀粉類的飼料原料100公斤，食鹽2公斤，含水量調節(jié)到55%左右，本品2包，簡單地攪拌均勻，密封發(fā)酵15天以上成為高濃度乳酸菌小肽豐富的生物蛋白飼料，喂前攤開透氣10分鐘再作為蛋白質原料使用于自配飼料中，可以等蛋白代替豆粕和玉米粉如：17%的發(fā)酵菜粕=10%的豆粕+7%的玉米粉，降低成本提高使用效果。

（六）中草藥及中藥渣發(fā)酵方法

1.固態(tài)中草藥發(fā)酵技術：將50公斤中草藥粉碎，越細越好放入40公斤的35℃左右的溫水中，加入玉米粉與豆粕各5公斤、本品1-2包、食鹽100克，放入塑料容器內壓實密封發(fā)酵7天以上后使用，密封可以保存一年以上，按照飼料比例的1%以上添加到飼料或飲水中使用。

2.液態(tài)中草藥發(fā)酵技術：1公斤中草藥+1包本品+1公斤紅糖+20公斤清水混合在非金屬容器中簡單密封發(fā)酵72小時以上后使用。每噸飼料中添加10公斤或每噸飲水中添加5公斤。

（七）直接拌料或飲水、制粒飼喂、制作水料

根據(jù)不同動物在每噸飼料添加本品2-4包，直接拌料或每包加入1.5-2噸飲水中使用；本產(chǎn)品采用微生物多層包被技術，在每噸3包本品混合飼料中直接制粒，90℃下5分鐘不會影響效果；動物采用水料水料（粥料）的制作：本品1-2包、500公斤全價飼料、1000公斤清水混合后發(fā)酵6小時以上后飼喂（預消化的輕度發(fā)酵模式），24小時內飼喂完。

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