豬腸道內(nèi)棲息著大量微生物，這些微生物菌群的組成與結構直接影響到營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和宿主健康。在正常情況下，豬腸道微生物群落的組成相對恒定，但在其遇到日糧、疾病及溫度的巨大變化時，豬消化道微生物群落的平衡會被打破，其生產(chǎn)性能也隨之受到影響。研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期母豬由于激素等內(nèi)分泌因子的變化，常引發(fā)腸道微生物菌群結構紊亂，誘發(fā)便秘，對母豬生產(chǎn)性能造成極大負面影響。因此，如何改善妊娠母豬腸道微生物菌群結構與組成、防止便秘的發(fā)生，已成為當前研究熱點。

選取2～3胎次的妊娠85d左右的健康經(jīng)產(chǎn)母豬16頭，隨機分為2組，每組8頭，分別為常規(guī)飼料組(對照組)和發(fā)酵飼料組(試驗組)。妊娠后期的日糧配方及營養(yǎng)水平見表1。發(fā)酵飼料的制作程序如下:采用保存于南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院消化道微生物實驗室的唾液乳桿菌L79、枯草芽孢桿菌B1121和釀酒酵母菌S1145制備菌液，并按質(zhì)量比2∶2∶1進行混合(復合菌的總數(shù)量約為1×10⁹cfu/g)，取對照組常規(guī)飼料，按2g/kg復合菌液添加于飼料底物中，調(diào)節(jié)飼料濕度為40%，混合均勻后分裝至單通閥發(fā)酵袋中，于37℃發(fā)酵2d?；?組所喂飼料的干物質(zhì)量相同的基礎上，飼喂前以6%的比例與常規(guī)飼料混合，將混合飼料作為試驗組日糧。試驗期間，每日飼喂2次，自由采食和飲水。試驗期從妊娠85d開始。期間記錄母豬的產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)和初生仔豬的重量。

在妊娠105d，采集各組的新鮮糞便樣品，取部分糞樣按質(zhì)量比1∶1與去離子水混合，5000g離心10min后，部分上清液凍置于－20℃冰箱中，用于乳酸濃度的測定，另一部分上清液中以5∶1的比例加入25%(W/V)偏磷酸與巴豆酸混合液，混勻后凍存于－20℃冰箱中過夜用于揮發(fā)性脂肪酸濃度的測定；取部分樣品于－20℃保存用于細菌DNA提取。

乳酸含量采用乳酸測試盒(A019－2)測定。測定揮發(fā)性脂肪酸的樣品解凍后，4 ℃、10000g離心10min，于GC－14B型氣相色譜儀(Shimadzu)測定含量，具體方法參照相關文獻。

糞便樣品DNA采用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit(Qiagen)提取。稱取 0.25g糞便樣品置于鋯珠管中，與1mL Inhibit Ex緩沖液及0.1g鋯珠 ( 直徑1毫米 ) 混勻，采用MiniBeadbeater1(Biospec Products Inc)以4800r/min的速度混合20s，重復3次。將混合物于95℃的水浴鍋中水浴5min。水浴后的混合物離心1min，取上清液置于新的1.5mL離心管中，并加入15μL蛋白酶K。測DNA濃度及純度。

在Illumina(MiSeq)平臺進行 DNA 雙端測序。使用細菌16sRNA 基因的 V3 ～ V4 區(qū)作為模板，進行 PCR 擴增。

擴增條件為:95℃ 2min；95 ℃1min，55℃ 1min，72℃ 1min，25個循環(huán)；72℃ 5min。測序得到的序列通過QIIME(v.1.8.0)軟件進行分析。將不含樣品信息的序列、過短或過長的序列、出現(xiàn)ambiguous堿基及含有過多homologous堿基的序列去除。在97%的相似度水平上利用UPARSE對非重復序列進行OTU歸類操作。利用稀疏曲線評價樣品的覆蓋率和取樣深度；使用Alpha多樣性指數(shù):ACE、Chao、Shannon和Simpson進行單樣本的多樣性分析；利用未加權的PCoA計算樣本間的差異性。

試驗所得數(shù)據(jù)經(jīng)Excel(2010)初步處理后，常規(guī)數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件中的獨立樣本t檢驗方法進行分析，高通量測序結果采用Kruskal－Wallis進行非參數(shù)檢驗。顯著性水平(P值)置于0.05。

結果與分析

如表2所示，與對照組相比，飼喂發(fā)酵飼料對母豬的總產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)和平均初生重無顯著影響(P＞0.05)。

糞便的乳酸及揮發(fā)性脂肪酸的含量如表3所示。與對照組相比，飼喂發(fā)酵飼料對糞便中的乳酸和丙酸含量無顯著影響(P＞0.05)。與對照組相比，飼喂發(fā)酵飼料顯著提高了糞便中乙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和戊酸的含量(P＜0.05)。

稀疏曲線結果顯示，各樣品中的微生物的稀疏曲線趨于平緩，說明取樣合理，測序深度足以反映檢測樣品的菌群多樣性(圖1A)。主坐標分析結果顯示，2組樣品無法明顯區(qū)分開，說明2組間的微生物菌群存在一定的相似性(圖1B)。如表4所示，與對照組相比，飼喂發(fā)酵飼料對母豬糞便微生物的OTU數(shù)、ACE、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均無顯著影響(P＞0.05)。

在門水平上，糞便樣品共檢測到19個菌門。2組的優(yōu)勢菌門均為 Bacteroidetes、Firmicutes和Spiro-chaetae，占糞便細菌菌群組成的91%以上。如表5所示，與對照組相比，飼喂發(fā)酵飼料顯著降低了Fi-brobacteres的相對豐度（P＜0.05)。在屬水平上，共檢測到262個屬，其中有20個菌屬的相對豐度大于1%。這20個屬的分析結果在表6展示。與對照組相比，飼喂發(fā)酵飼料顯著降低了Oscillospira和Fibrobacter的相對豐度(P＜0.05)，有提高Blautia和Bacteroides 相對豐度的趨勢(P＜0.1)。

發(fā)酵飼料作為一類新型飼料，其在仔豬生產(chǎn)中得到廣泛應用。研究發(fā)現(xiàn)，仔豬日糧中添加發(fā)酵飼料，可顯著提高斷奶仔豬的成活率和平均斷奶重，降低哺乳仔豬的腹瀉率，從而提高母豬的生產(chǎn)性能。但目前有關發(fā)酵飼料對母豬生產(chǎn)性能的影響的報道較少，本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂發(fā)酵飼料對母豬產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)以及仔豬初生重無顯著影響，結果說明母豬窩產(chǎn)仔數(shù)等生產(chǎn)性能指標更易受妊娠早期胚胎存活率的影響。豬腸道微生物主要棲息于消化道后段，胃和小腸未消化吸收的營養(yǎng)素進入后腸，經(jīng)微生物發(fā)酵，產(chǎn)生大量發(fā)酵產(chǎn)物，進而可被機體吸收，發(fā)酵產(chǎn)物進入機體可起到供能及調(diào)控宿主代謝與免疫的作用。本試驗中，飼喂發(fā)酵飼料顯著提高了糞便中乙酸和丁酸的含量。在這些揮發(fā)性脂肪酸中，乙酸可作為肝臟和外周組織的能量來源，也可作為糖原異生和脂肪生成代謝途徑中的信號分子。丁酸是結腸細胞的主要能量來源，可以預防炎癥，同時其還可抑制腸道內(nèi)的病原菌或腐敗菌生長，促進益生菌的生長和增殖。有研究發(fā)現(xiàn)，丁酸在腸上皮細胞凋亡和增殖的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。本研究表明，飼喂發(fā)酵飼料促進了母豬腸道微生物發(fā)酵，提高了糞便中揮發(fā)性脂肪酸的含量，因而對改善母豬腸道健康具有重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂發(fā)酵飼料影響了母豬腸道微生物菌群的組成。與對照組比較，試驗組母豬糞便中的Oscillospira和Fibrobacter屬的微生物的相對豐度顯著降低，Blautia和Bacteroides的相對豐度有升高的趨勢。Blautia是結腸中存在的一種產(chǎn)乙酸菌，其豐度的升高與糞便中乙酸含量升高相一致。Bacteroides是腸道中普遍存在的一種菌，據(jù)報道，Bacteroides屬微生物可以消化一些宿主難以消化的多糖，從而為機體供能。最近有研究表明，飼喂微生物發(fā)酵飼增加了斷奶仔豬腸道菌群中的 Bacteroides屬微生物的比例，該結果也與本試驗的研究結果一致。Fibrobacter是一類纖維降解菌，其具有高纖維素分解活性，并且能夠降解難降解的植物結構多糖。Fi-brobacter在試驗組含量降低的原因分能是由于飼料經(jīng)過益生菌發(fā)酵后，纖維素的含量降低，殘留的纖維素被其他纖維降解菌分解所致。Oscillospira是結腸中一種常見菌，生長緩慢，有研究指出，這種緩慢生長關系著結腸的蠕動，并與便秘發(fā)生與否成正相關。本試驗中，飼喂發(fā)酵飼料導致Oscillospira屬微生物的豐度下降，暗示發(fā)酵飼料可能有利于降低母豬便秘的發(fā)生，從而有益于腸道健康。

綜上所述，飼喂發(fā)酵飼料可以平衡母豬腸道微生態(tài)，對腸道健康有益生作用，但對母豬的產(chǎn)仔性能未產(chǎn)生顯著影響。