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導(dǎo)讀

我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó), 作物秸稈作為農(nóng)業(yè)重要的副產(chǎn)品, 資源總量已超過(guò)8億噸。秸稈因其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及適口性差, 消化率低, 飼用化率僅為26%左右。近年來(lái), 利用發(fā)酵技術(shù)將秸稈纖維轉(zhuǎn)化為動(dòng)物易消化吸收的蛋白飼料已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。目前存在的主要問(wèn)題是菌種單一、酶系不全、發(fā)酵周期長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化效率低。

本研究根據(jù)不同微生物的代謝特征和協(xié)同機(jī)理, 考察混合菌群發(fā)酵小麥秸稈合成菌體蛋白的菌種配比及其接種順序等影響蛋白產(chǎn)率的關(guān)鍵因素, 以達(dá)到發(fā)酵過(guò)程中菌群間的協(xié)調(diào)、互補(bǔ)作用。

1實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料1.1.1 菌種

米曲霉 (Aspergillus oryzae) 、熱帶假絲酵母 (Candida tropicalis) 由陜西省酶工程研究所提供;產(chǎn)朊假絲酵母菌 (Candida utilis) 、枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) 由陜西省微生物研究所提供。

1.1.2 原料

纖維素酶由陜西省科學(xué)院酶工程研究所提供, 酶活力單位為1.4×105U/g。小麥秸稈產(chǎn)于陜西省西安市臨潼區(qū), 含水量9.18%, 粉碎后待用。本文所用小麥秸稈質(zhì)量均以絕干物料計(jì)量。

1.1.3 培養(yǎng)基

(1) 液體種子培養(yǎng)基

a.米曲霉培養(yǎng)基:蔗糖3%, NaNO30.3%, MgSO4·7H2O 0.05%, KCl 0.05%, FeSO4·4H2O0.001%, K2HPO40.1%。

b.酵母菌培養(yǎng)基:葡萄糖2%, 蛋白胨1%, 酵母膏0.5%。

c.枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基:蛋白胨0.5%, 肉膏0.3%, NaCl 0.5%, pH自然。

(2) 發(fā)酵培養(yǎng)基

小麥秸稈100g, 無(wú)機(jī)鹽溶液300mL (組成為:尿素1.2%, (NH4) 2SO41.5%, MgSO4·7H2O0.05%, KH2PO40.2%) 。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 預(yù)處理方法

發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后, 采用纖維素酶進(jìn)行發(fā)酵前預(yù)處理, 使秸稈中的纖維素降解為單糖或低聚糖, 為后期微生物合成單細(xì)胞蛋白提供碳源。最適的酶解條件為:加酶量40U/g, 反應(yīng)溫度40℃, 酶解時(shí)間10h, 總糖含量43.24%。

1.2.2 分析方法

粗蛋白含量測(cè)定采用微量凱氏定氮法, 纖維素酶活力測(cè)定采用3, 5-二硝基水楊酸法 (DNS顯色法)。

1.2.3 工藝流程

新的發(fā)酵工藝流程如下:

2結(jié)果與討論

2.1 菌種篩選

將各發(fā)酵菌種的種子液按表1中的組合方式及順序 (組合1為對(duì)照組, 不添加任何菌種) 接入經(jīng)纖維素酶水解后的固體培養(yǎng)基中, 各接種量均為5%, 30℃靜置發(fā)酵24h。定時(shí)攪拌以保持發(fā)酵物料各部位均勻, 防止結(jié)塊。結(jié)束后烘干, 測(cè)定粗蛋白含量。

五種組合對(duì)蛋白質(zhì)含量的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知, 組合5為最優(yōu)的菌種組合, 因此選擇米曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌作為混合發(fā)酵的菌種。

2.2 接種順序及時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)量的影響

米曲霉可產(chǎn)生纖維素酶, 發(fā)酵前期應(yīng)作為先導(dǎo)菌進(jìn)一步分解殘留的粗纖維, 為后期微生物合成菌體蛋白提供充足的碳源。在生產(chǎn)蛋白質(zhì)的菌株中, 酵母菌在營(yíng)養(yǎng)豐富的環(huán)境中繁殖最旺盛, 一些代謝產(chǎn)物又是細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此我們將接種的時(shí)間順序設(shè)計(jì)為:米曲霉→產(chǎn)朊假絲酵母→枯草芽孢桿菌。此外, 如何控制接入各菌種的時(shí)間, 以達(dá)到菌種之間的協(xié)調(diào)、互補(bǔ)作用, 也是影響粗蛋白產(chǎn)率的關(guān)鍵因素之一。

實(shí)驗(yàn)采用分段接種法, 先將米曲霉種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵, 考察不同時(shí)間段接入酵母菌及枯草芽孢桿菌對(duì)合成粗蛋白產(chǎn)量的影響, 各接種量均為5%。

2.2.1 產(chǎn)朊假絲酵母的接種時(shí)間對(duì)粗蛋白產(chǎn)量的影響

分別于米曲霉發(fā)酵過(guò)程中的不同時(shí)間段接入酵母菌種子液, 3h后再接入枯草芽孢桿菌種子液。于30℃靜置發(fā)酵24h, 取樣烘干, 測(cè)定粗蛋白含量。由圖2可知, 12h左右接入酵母菌的粗蛋白產(chǎn)量最高, 為11.16%。

2.2.2 枯草芽孢桿菌的接種時(shí)間對(duì)粗蛋白產(chǎn)量的影響

接種米曲霉發(fā)酵12h后, 再接種產(chǎn)朊假絲酵母, 然后分別于不同時(shí)間接入枯草芽孢桿菌種子液, 繼續(xù)發(fā)酵24h, 取樣烘干, 測(cè)定粗蛋白含量。

由圖3可知, 接種酵母菌8h后再接入枯草芽孢桿菌的粗蛋白產(chǎn)量最高, 為12.59%。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

本著以粗代精、以廢代好、降低成本的原則, 對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。麩皮含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素及微量元素, 可為微生物發(fā)酵提供天然的有機(jī)碳源、氮源和營(yíng)養(yǎng)因子。實(shí)驗(yàn)考察了發(fā)酵培養(yǎng)基中秸稈與麩皮的不同配比對(duì)生物合成蛋白質(zhì)的影響。由圖4可知, 秸稈與麩皮的最適配比為3∶1, 粗蛋白產(chǎn)量為23.19%。

2.4 部分顯著因素的正交試驗(yàn)

在對(duì)微生物發(fā)酵體系中各參數(shù)進(jìn)行不同水平測(cè)定的基礎(chǔ)上, 確定了影響菌體蛋白產(chǎn)量的主要因素是接種量、菌種比例、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、秸稈與麩皮配比。因此, 選擇上述五項(xiàng)為主要因素, 采用L16 (45) 正交試驗(yàn)表進(jìn)行5因素4水平的正交實(shí)驗(yàn), 以考察上述因素之間的相互影響和各因素水平的變化, 結(jié)果如表2所示。

通過(guò)直觀分析法, 從表3的極差分析可知, 在所選的因素水平范圍內(nèi), 秸稈與麩皮的比例對(duì)發(fā)酵體系影響較大, 各因素影響的主次順序?yàn)?E>B>D>A>C, 并確定了最佳條件組合為A2B2C1D4E3, 即接種量為10%, 接種比例為1∶2∶1, 發(fā)酵溫度為28℃, 發(fā)酵時(shí)間48h, 秸稈與麩皮配比為4∶1。通過(guò)發(fā)酵, 物料中粗蛋白含量由起始時(shí)的5.47%提高到27.13%。

3最佳發(fā)酵條件下動(dòng)力學(xué)模型的建立

微生物發(fā)酵反應(yīng)過(guò)程非常復(fù)雜, 利用數(shù)學(xué)擬合模型構(gòu)建發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模式, 具有簡(jiǎn)單、易于分析驗(yàn)證和實(shí)現(xiàn)計(jì)算自動(dòng)化的特點(diǎn)。建模的目的是為了更深刻的了解微生物復(fù)雜的代謝本質(zhì), 從而尋求最適的操作條件, 實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程的最優(yōu)化。

3.1 動(dòng)力學(xué)模型的選擇

描述菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)最常用的是Monod方程和Logistic方程, 其中Monod方程假設(shè)菌體生長(zhǎng)為均衡型非結(jié)構(gòu)式生長(zhǎng), 細(xì)胞成分只需要用一個(gè)參數(shù)即菌體濃度表示;培養(yǎng)基中只有一種底物是生長(zhǎng)限制性底物, 其它組分含量充分, 不影響微生物生長(zhǎng);將微生物生長(zhǎng)視為簡(jiǎn)單反應(yīng), 并假設(shè)菌體得率為常數(shù), 沒(méi)有動(dòng)態(tài)滯后。在秸稈發(fā)酵過(guò)程中, 采用的混合菌群包括霉菌、酵母菌和細(xì)菌, 由于不同菌株之間的相互作用、生長(zhǎng)環(huán)境的改變、代謝產(chǎn)物的反饋抑制以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散限制, 導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)遲緩等異?，F(xiàn)象, 故不宜采用Monod方程來(lái)描述此過(guò)程。

Logistic方程是一個(gè)典型的S曲線, 能很好的反應(yīng)混合菌群發(fā)酵小麥秸稈過(guò)程中菌體濃度的增加對(duì)自身生長(zhǎng)的抑制作用, 具有廣泛的適用性。由于菌體量和蛋白增加量存在某一統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的相互關(guān)聯(lián), 故可以用宏觀的蛋白質(zhì)含量變化來(lái)間接描述菌體的生長(zhǎng)過(guò)程。

3.2 動(dòng)力學(xué)方程的參數(shù)確定

動(dòng)力學(xué)方程對(duì)于了解發(fā)酵機(jī)理、掌握整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中混合菌群生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)變化、優(yōu)化發(fā)酵工藝具有重要的指導(dǎo)意義。設(shè)X、X0、Xm、K分別為粗蛋白含量的增加量 (%) 、初始增量 (%) 、最大增加量 (%) 和比生長(zhǎng)速率常數(shù) (h) , 則:

應(yīng)用Origin7.5軟件中的非線性方程Slogistic3, 將表4中最適條件下發(fā)酵反應(yīng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行最優(yōu)化擬合, 結(jié)果如圖5所示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和擬合曲線基本吻合, 且最大粗蛋白增加量Xm=23.38%, 比生長(zhǎng)速率常數(shù)K=0.15/h, b=46.81;最大誤差分別為±0.45、±0.008 6和±8.9, 誤差值均低于10%, 說(shuō)明該方程能夠近似描述混合菌群發(fā)酵秸稈合成蛋白質(zhì)的菌體生長(zhǎng)過(guò)程。令粗蛋白增加速度為

, 因此, 發(fā)酵過(guò)程中粗蛋白的增加量隨著時(shí)間變化的數(shù)學(xué)模型為:

作粗蛋白量增加速度v和加速度dv/dt隨時(shí)間t的變化曲線, 結(jié)果如圖6和圖7所示。

由圖6和圖7可知, 粗蛋白增長(zhǎng)速度在26h左右達(dá)到最大, 即vmax=0.87%/h。在16h和35h左右dv/dt達(dá)到峰值, 即dv/dt=±0.05%/h2。由此可以認(rèn)為, 在16h以前為發(fā)酵的延遲期, 35h以后為發(fā)酵的衰亡期, 這之間的時(shí)間段為發(fā)酵的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期和穩(wěn)定期。圖中曲線反應(yīng)了整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中混合菌群生長(zhǎng)的內(nèi)部變化規(guī)律, 可作為控制發(fā)酵生產(chǎn)周期的重要依據(jù)。

根據(jù)微生物群體的生長(zhǎng)規(guī)律, 穩(wěn)定期細(xì)胞濃度達(dá)到極大值, 發(fā)酵產(chǎn)物在此階段形成和積累。動(dòng)力學(xué)分析表明, 正交實(shí)驗(yàn)所顯示的最適發(fā)酵時(shí)間48h已是混合菌群的衰亡期, 發(fā)酵合成菌體蛋白的發(fā)酵時(shí)間應(yīng)控制在穩(wěn)定期末期即35h結(jié)束, 此時(shí)收獲的發(fā)酵產(chǎn)品既保證了較高的蛋白含量, 而且有害代謝產(chǎn)物少, 粗蛋白含量為25%左右。

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的最適分段接種工藝為:首先接種米曲霉, 發(fā)酵12h后再接種產(chǎn)朊假絲酵母, 繼續(xù)發(fā)酵8h再接種枯草芽孢桿菌。以麩皮作為天然的有機(jī)碳源和氮源可以大大降低生產(chǎn)成本。對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后的組成為:小麥秸稈與麩皮配比為4∶1, 1.5% (NH4) 2SO4, 0.05%MgSO4·7H2O, 0.2%KH2PO4和1.2%的尿素, 料液比為1∶3。

正交實(shí)驗(yàn)表明, 影響發(fā)酵主要因素的主次順序?yàn)?秸稈與麩皮配比>接種比例>發(fā)酵時(shí)間>接種量>發(fā)酵溫度;發(fā)酵的最適條件為:總接種量為10%, 米曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌的接種比例為1∶2∶1, 發(fā)酵溫度為28℃, 發(fā)酵時(shí)間48h。發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量達(dá)到27.13%。

動(dòng)力學(xué)分析有助于了解整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中混合菌群生長(zhǎng)的內(nèi)部變化規(guī)律, 可作為控制發(fā)酵生產(chǎn)周期的重要依據(jù)。本研究表明, 發(fā)酵的穩(wěn)定期在26~35h之間。因此, 將最適發(fā)酵周期由48h優(yōu)化為35h, 發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量為25%左右。

本研究在前期利用纖維素酶降解小麥秸稈的基礎(chǔ)上, 通過(guò)混合菌群的協(xié)同發(fā)酵作用, 有效轉(zhuǎn)化秸稈粗纖維, 提高了菌體蛋白含量;對(duì)微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行探討, 確定了相關(guān)的動(dòng)力學(xué)參數(shù), 改進(jìn)了發(fā)酵工藝條件, 具有發(fā)酵周期短、有害代謝產(chǎn)物少、減少能耗、生產(chǎn)成本低, 蛋白質(zhì)含量高的特點(diǎn), 對(duì)于將秸稈纖維轉(zhuǎn)化為蛋白飼料的發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供了參考。