添加生物飼料對肉牛大理石紋相關基因表達的影響

2020-12-25 16:53:35 點擊：

摘要：為探究日糧中添加生物飼料對肉牛肉質(zhì)的影響，將隨機選擇的年齡（28～29月齡）、體型相近的40頭日本和?！燎卮ㄅｋs交 F1 育肥閹牛，隨機分為對照組和試驗組，分別添加0%和8%的生物飼料；飼養(yǎng)期為5個月，每個月進行一次體重測定；飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，每組隨機挑14頭進行屠宰，測量12～13肋間眼肌面積，并對大理石紋進行評分；采用實時熒光定量 PCR 技術檢測試驗組和對照組背最長肌甲狀腺球蛋白（TG）、過氧化物酶體增殖物激活受體 α（PPARα）和過氧化物酶體增殖物激活受體 β（PPARβ）基因的表達量。結(jié)果表明，試驗組的眼肌面積大小和大理石紋評分極顯著高于對照組（P＜0.01）；試驗組牛 TG 和 PPARα 基因表達量顯著高于對照組（P<0.05），PPARβ 基因表達量高于對照組，但未達顯著水平（P＞0.05）。由此表明,日糧中添加活性干酪乳桿菌和釀酒酵母生物飼料可上調(diào)與動物脂肪代謝相關基因 PPARα 和與肉牛大理石花紋脂肪沉積相關基因 TG 的表達，促進肉牛肌內(nèi)脂肪（IMF）沉積，提升牛肉大理石花紋等級。

隨著社會經(jīng)濟的迅速發(fā)展，人們對高品質(zhì)牛肉的需求與日俱增。肌內(nèi)脂肪（intramuscular fat, IMF）可對牛肉品質(zhì)和脂肪沉積產(chǎn)生積極影響，與個體的生長發(fā)育及屠宰性能緊密相關，肌內(nèi)脂肪含量達到0%便能呈現(xiàn)理想的大理石花紋，才可被稱作高檔牛肉。試驗證實，過氧化物酶體增殖激活受體（peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs）家族基因在動物脂肪代謝過程中起著重要的調(diào)控作用，根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同可分為 PPARα、PPARβ 和 PPARγ 三種亞型，具有調(diào)節(jié)脂肪代謝、炎癥反應、脂肪細胞生長分化等功能。國外學者證實三碘甲腺原氨酸和甲狀腺球蛋白（Thyroglobulin, TG）與肉牛大理石花紋脂肪沉積相關，并且還出現(xiàn)了商品化的基因測試。此外，該基因端多態(tài)性與提高脂肪總量相關，是大理石花紋沉積的標志基因。我國在21世紀初便開始對生物飼料的探索，出現(xiàn)以發(fā)酵技術和生物活性添加劑為主的飼料添加產(chǎn)品。其中，巴斯德生物飼料是將液態(tài)添加劑干酪乳桿菌、飼料添加劑釀酒酵母等與飼料原料稻糠、飼料原料玉米胚芽餅等按一定比例混合、發(fā)酵，制成的活性干酪乳桿菌和釀酒酵母產(chǎn)品，可提高奶牛產(chǎn)奶性能和肉牛的產(chǎn)肉性能。Butler 和 Kumar 團隊研究發(fā)現(xiàn)肌肉組織和肉類的抗氧化能力取決于在飼料中作為最重要的內(nèi)部因素的助氧化劑和抗氧化劑之間的平衡，以及肉中脂質(zhì)的脂肪酸分布。通過在飼料中加入抗氧化劑或天然抗氧化劑，可以改善家禽和豬等非反芻動物肉類的氧化穩(wěn)定性。對于反芻動物，瘤胃微生物菌群在吸收前會降低脂質(zhì)不飽和的程度，并調(diào)節(jié)飼料成分對肉的影響。迄今為止，我國在應用生物飼料提高牛肉品質(zhì)方面的研究還處于探索階段。因此，本研究旨在通過添加活性干酪乳桿菌和釀酒酵母生物飼料飼喂肉牛，對試驗牛進行宰前體重測量及宰后生產(chǎn)測定如大理石花紋面積測量和大理石花紋等級評分，采用 qRT-PCR 方法檢測與大理石花紋沉積相關基因 TG 和與脂肪代謝相關基因 PPARα、PPARβ mRNA水平的表達量變化，探討生物飼料飼喂影響肉牛脂肪沉積的相關分子機理，以期為高品質(zhì)肉牛培育提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設計

選擇體況評分基本一致、28～29月齡的和?！燎卮ㄅｋs交F1代育肥牛40 頭作為試驗用牛，隨機分為試驗組與對照組（每組20頭牛）。日糧根據(jù)我國《肉牛飼養(yǎng)標準》（NY/T 815-2004）進行飼喂表1，試驗組牛飼喂日糧中添加8%的生物飼料，對照組牛正常（即生物飼料添加量為0%）飼喂。飼喂預試期為 5月10日至19日（第1天給試驗組添加2%的生物飼料，逐日增加至8%），飼喂正試驗為5月20日至10月10日。

1.2 部分生長性能和屠宰性能的測定

體增重：在試驗期的第1、30、60、90、120、150天上午對試驗牛分別空腹稱重并記錄。眼肌面積測定：飼喂試驗結(jié)束后，按照《鮮、凍分割牛肉：GB/T 17238-2008》標準屠宰試驗牛，將牛的二分胴體4℃排酸72h后，測定胴體12～13肋間背最長肌的橫切面面積（先用硫酸紙繪出眼肌橫切面的輪廓，然后再由眼肌面積測量板測定）。大理石花紋等級評分：按照《牛肉等級規(guī)格：NYT 676-2010》對大理石花紋肉評分，評分等級由低到高依次為1到5分，由3人同時評分取中值。

1.3 試驗樣品采集

飼喂試驗結(jié)束后屠宰，立即從胴體第12～13肋骨間采集背最長肌，經(jīng)無菌無 RNA 酶處理水沖洗后，剪切成小塊（厚度約0.3cm）立即液氮冷凍保存，用于提取 RNA 后測定基因表達。

1.4 RNA 提取

采用 UNlQ-10 柱式 Trizol 總 RNA 抽提試劑盒（生工生物，編號：B511321），按照產(chǎn)品說明書提取牛背最長肌總 RNA，用 SMA4000 微量分光光度計檢測總 RNA 的濃度，取3 μL 總 RNA 樣品用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查其完整性。

1.5 基因表達的測定

將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用Primer Premier 5.0 設計 qRT-PCR 引物表2，并委托生工（上海）生物公司合成。用 β-actin 作為內(nèi)參基因。

2.2 添加生物飼料對日本和?！燎卮ㄅ1育肥牛眼肌面積的影響

眼肌面積測量結(jié)果如表4所示，與對照組（83.63±3.94）cm2相比，試驗組牛的眼肌面積（89.73±4.11）cm2顯著增加了7.30%（P<0.01）。

2.3 添加生物飼料對日本和?！燎卮ㄅ1育肥牛大理石紋評分的影響

圖1為試驗牛大理石紋對比圖，可以直觀看出試驗組牛較對照組肌內(nèi)脂肪含量高，大理石花紋明顯。圖2是試驗牛大理石紋等級評分分布，其中試驗組5級牛有5頭，4級牛有7頭，分別占屠宰牛數(shù)的35.71%和50%, 均高于對照組的7.14%和35.71%；對照組中3級牛占比重最大，為對照組屠宰牛的50%，而試驗組中3級牛僅占14.29%且無2級牛。試驗組牛眼肌大理石花紋等級評分（4.21±0.69）極顯著（P<0.01）高于對照組肉牛（3.43±0.75）。

2.3 添加生物飼料對日本和牛×秦川牛F1育肥牛大理石紋評分的影響

2.4 添加生物飼料對日本和?！燎卮ㄅ1育肥牛TG/PPARα/PPARβ基因相對表達量的影響

由圖3可知，與對照組相比，添加生物飼料的肉牛眼肌肉組織中 TG 基因和PPARα基因的表達量分別提高了94.44%和55.93%，差異均顯著（P

3 討論與結(jié)論

3.1 添加生物飼料對日本和?！燎卮ㄅ1育肥牛增重的影響

本試驗結(jié)果表明日糧中添加生物飼料，可使肉牛的平均總增重和日增重分別提高11.78%和12.63%。可見日糧中添加活性干酪乳桿菌和釀酒酵母生物飼料的飼料模式可以提高育肥牛的整體增重水平。這種育肥效果是有理可循的，生物飼料中微生物中含有大量的益生菌，在動物體內(nèi)產(chǎn)生一些具特殊的小肽物質(zhì)，從而參與機體生理代謝、促進氨基酸和礦物質(zhì)的吸收與富集，提高蛋白質(zhì)的合成效率，飼料中添加活性干酪乳桿菌和釀酒酵母使胃腸環(huán)境產(chǎn)生抑菌能力，從而促進動物生長發(fā)育。此外，生物發(fā)酵飼料中的活性細胞進入瘤胃而刺激胃內(nèi)容物的生成，使纖維分解菌和厭氧菌大量繁殖，從而提高了飼料的轉(zhuǎn)化率。這與麻名漢和曹蕾等報道研究結(jié)論相似。段鵬杰在秦川牛日糧中添加谷氨酸渣，發(fā)現(xiàn)其可以顯著提高育肥期公牛和育肥前、中期母牛的日增重，這與本研究對育肥期牛添加活性干酪乳桿菌和釀酒酵母的結(jié)果一致；高慧蘭等在西門塔爾牛日糧中添加0.5%的釀酒酵母培養(yǎng)物對肉牛增重效果顯著。吳道義等向2歲大小的雜交肉牛飼喂1%的酒糟生物飼料也可以顯著提高肉牛體重，結(jié)論與本試驗一致。

3.2 添加生物飼料對日本和?！燎卮ㄅ1育肥牛眼肌面積的影響

眼肌面積可作為評定牛屠宰后胴體品質(zhì)的重要指標之一，且與肉牛肉的產(chǎn)出也存在緊密的關聯(lián)性。結(jié)果顯示試驗組牛的眼肌面積較對照組大7.30%, 差異極顯著（P

3.3 添加生物飼料對日本和?！燎卮ㄅ1育肥牛大理石花紋評分的影響

本試驗經(jīng)過評定得出，試驗組肉牛屠宰評定的大理石紋等級較空白對照組提高了20.29%，差異顯著（P<0.05）。耿春銀在利木贊牛飼糧中添加酵母益生菌飼料可以獲得更高的牛肉大理石紋（P

3.4 添加生物飼料對日本和?！燎卮ㄅ1育肥牛TG/PPARα/PPARβ基因相對表達量的影響

肌內(nèi)脂肪（IMF）沉積與脂肪酸合成能力密切相關，當脂肪酸合成加強就提高了 IMF 含量，進而促進大理石花紋的形成。TG 基因與處于生長育肥期牛的大理石花紋性狀顯著相關；而 PPARs基因家族的主要作用是正向調(diào)控脂肪代謝相關基因的表達，從而控制脂肪酸的合成。本試驗選用28～29月齡、處在肌內(nèi)脂肪沉積期的肉牛，試驗組牛背最長肌 TG 基因較對照組有顯著（P<0.05）上調(diào)作用，李奎的研究表明復合酶制劑可以顯著提高青年安格斯牛 TG 基因的表達水平，說明活性干酪乳桿菌和釀酒酵母等生物飼料可能促進青年牛 TG 基因的表達，進而提高牛的大理石花紋水平。苗海明研究不同營養(yǎng)水平對蒙古綿羊肌內(nèi)脂肪沉積相關基因 mRNA 表達量的影響，發(fā)現(xiàn)低能量水平促進 PPARs基因的表達，高蛋白水平抑制了 PPARs基因的表達；魏巧麗在肉牛飼料中添加 β-胡蘿卜素，可使 PPARs 表達量下降，使皮下脂肪和肌內(nèi)脂肪分化水平受到抑制。日糧中添加活性干酪乳桿菌和釀酒酵母飼料在未改變牛日糧的營養(yǎng)水平的條件下，對 PPARα基因（P

4 結(jié) 論

本試驗表明添飼活性干酪乳桿菌和釀酒酵母生物飼料對和秦F1育肥牛的體增重沒有顯著的提高作用，但在該飼料中的微生物中含有大量的益生菌，在動物體內(nèi)產(chǎn)生一些具特殊的小肽物質(zhì)，從而參與機體生理代謝、促進氨基酸和礦物質(zhì)的吸收與富集，促進 PPARα（P<0.05）、TG（P<0.05）基因的表達，從而提高蛋白質(zhì)的合成效率，使得試驗組牛的眼肌面積較對照組增加7.6%和大理石紋等級評分提高20.29%。Lund 等發(fā)現(xiàn)脂類物質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化是肉類和肉類產(chǎn)品質(zhì)量惡化的主要非微生物因素，通過在飼料中加入抗氧化劑或天然抗氧化劑，可以改善家禽和豬等非反芻動物肉類的氧化穩(wěn)定性。因此猜測，活性干酪乳桿菌和釀酒酵母生物飼料是否有抗氧化劑成分從而改善了大理石紋，還需要更多的研究來驗證。在基礎日糧中添加活性干酪乳桿菌和釀酒酵母生物飼料進行育肥，可以顯著提高日本和?！燎卮ㄅｋs交F1牛的背最長肌組織中 TG、PPARα 基因的表達，并顯著提高眼肌面積和大理石花紋評分等級，可為肉牛育肥的飼料配方提供基礎資料。

生物發(fā)酵飼料的制作方法

生物發(fā)酵飼料不是什么高大上的東西，只要有專業(yè)的飼料發(fā)酵劑+原料就可以自己制作。所需的材料和設備都要求不高，具體做法是：

1.按照配方分別稱取原料（參考配方1：玉米50%、豆粕或菜粕50%；參考配方2：60%全價配合飼料、豆粕40%；參考配方3:100%的豬雞鴨全價飼料。配方中蛋白飼料越多效果越好。

2.選用含復合菌+復合酶制劑組合的酶菌結(jié)合飼料發(fā)酵劑，特別推薦選用“99多功能飼料發(fā)酵劑”這個發(fā)酵劑，500克/包，市場售價僅25元，發(fā)酵1-2噸飼料，使用量越大效果越好，菌種品種和數(shù)量多，且含豐富酶制劑分解飼料中的粗纖維效果好，且發(fā)酵完成的飼料香甜味和適口性更好。

3.將菌種溶于溫水中半小時以上，加入少量紅糖或糖蜜效果更好，然后均勻噴灑在發(fā)酵料中，邊拌邊灑，使發(fā)酵料的含水量達到手捏成團、落地即散的程度，一般料含水量55%-60%比較好。

4.將拌好的發(fā)酵飼料裝于塑料桶或陶瓷缸中或水泥池內(nèi)，稍將料壓實后密封讓其自然發(fā)酵。一般氣溫在25℃以下時，發(fā)酵時間為7--10天，氣溫在25℃以上時，則為3--5天。

5.發(fā)酵后，pH值達到4--5以下，并有濃郁的酒香味，即為發(fā)酵成功。

發(fā)酵飼料制作現(xiàn)場

【視頻】部分發(fā)酵飼料養(yǎng)豬雞鴨帶給你無臭味健康無抗養(yǎng)殖效果

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2020年已全面禁抗，我們之前經(jīng)常在飼料中添加的抗生素進行促生長行為將是違法，否則面臨巨額罰單。如何既能夠促進動物生長又能夠形成無抗養(yǎng)殖呢？其實中草藥在促進畜禽養(yǎng)殖健康和生長、改善肉蛋奶品質(zhì)大有可為，特別是將中草藥發(fā)酵后效果提升4-28倍等好處，這個實施方案比你想象中效果更好，運用的沒有不被效果折服的，值得嘗試驗證

我們的技術僅需在出欄前半個月左右運用益生菌+酶制劑+中草藥相關的無違禁安全產(chǎn)品，肉質(zhì)改善非常顯著，且可以批量化生產(chǎn)。

目前我們已經(jīng)有了成熟的技術、產(chǎn)品和運用方案，且有大量成功案例，可以在短時間、批量化、安全無違禁地為您的養(yǎng)殖場生產(chǎn)出高品質(zhì)的家畜、家禽、水產(chǎn)產(chǎn)品。

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