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1.1 材料

1.1.1 樣品

牛糞、全株玉米青貯、土壤、牛奶、實驗室保存的菌株等。

1.1.2 試驗菌株

黃曲霉（Aspergillus flavus），由河北農(nóng)業(yè)大學真菌毒素與分子病理學實驗室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化鈉8.5 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、葡萄糖1 g/L，pH 6.5 

香豆素培養(yǎng)基：KH₂PO₄ 0.25 g/L、MgSO₄ 0.205 g/L、KNO₃ 0.5 g/L、（NH₄）₂SO₄ 0.5g/L、CaCl₂ 0.004 g/L、FeCl₃ 0.002 g/L，pH 7.0， 加入1 g 香豆素，固體培養(yǎng)基加入2%的瓊脂粉。

1.1.4 試劑

香豆素，COOLABER科技有限公司；黃曲霉毒素標準品，美國Sigma 公司；黃曲霉毒素試劑盒，北京某公司；PCR 相關(guān)試劑，北京某公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離

稱取土壤、牛糞等樣品各10.0 g，分別加到裝有100 mL 無菌水的三角瓶中，放于37 ℃，180 r/min 搖床中30 min。吸取混勻后的溶液1.0 mL 于裝有9.0 mL 無菌水的試管中，用漩渦振蕩儀混勻，將混勻液逐級稀釋至10^-7濃度。

分別吸取各種樣品稀釋度為10^-5 ～ 10^-7 的溶液100 μL 均勻涂布在NA 培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h 后挑選菌落形態(tài)各不相同的單菌落劃線從而進一步純化， 培養(yǎng)后觀察菌落形態(tài)并編號記錄，挑選單菌落接種至相應(yīng)的斜面，置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 菌株初篩

挑取保存在斜面上的菌株，分別點接在香豆素培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)，如有菌落長出，則在香豆素培養(yǎng)基上傳代3 次，如傳代3次仍生長，則記錄該菌株編號，進入后續(xù)試驗。

1.2.3 菌株復篩

制作病原菌平板，待平板凝固后，使用直徑為1 cm 的打孔器打孔。將初篩得到的菌株分別接種至NB 培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)12 h，以5%接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h。取發(fā)酵液1.5 mL，10000 r/min 離心10 min，取上清液80 μL 注入病原菌平板的孔中，放在37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察是否有抑菌圈的出現(xiàn)，并記錄抑菌圈的直徑。

選擇抑菌圈直徑較大的菌株接種NB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h 后， 轉(zhuǎn)接到含AFB₁10 μg/mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3 d。通過酶聯(lián)免疫試劑盒檢測發(fā)酵液中剩余的AFB₁ 濃度，并計算AFB₁ 降解率。

1.2.4 菌株的鑒定

1.2.4.1 菌株的形態(tài)學鑒定

對菌落大小、菌落顏色、菌落質(zhì)地、菌落邊緣等特征進行鑒別。

1.2.4.2 菌株的分子生物學鑒定

利用PCR技術(shù)對菌落16S rDNA 進行擴增，并將純化的PCR 產(chǎn)物送測序公司進行測序分析。將測序結(jié)果用BLAST軟件與GenBank 中已登錄的16S rRNA 基因序列進行同源性比較，通過CLUSTALX 和BIOEDIT等軟件進行多重序列比對分析，并以Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（王偉等，2014）。

1.2.4.3 菌株的生理生化試驗

根據(jù)16S rDNA序列分析的結(jié)果，對供試菌株進行生理生化試驗，包括硝酸鹽還原、厭氧生長、淀粉水解、明膠液化、V-P 測定、D-甘露醇發(fā)酵和丙酸鹽利用等。

1.2.5 菌株的性質(zhì)研究

1.2.5.1 菌株的pH 耐受性

制備種子液，按6.0%的接種量接種于pH 分別為3.5、4.5、5.5、6.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)2 d后，測定菌株的生物量。

1.2.5.2 菌株的溫度耐受性

制備種子液，按6.0%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在17、27、37、47 ℃，180 r/min 搖床培養(yǎng)2 d后，測定菌株的生物量。

2.1 菌株的分離及初篩

共分離得到120株菌，其中45株菌可以在以香豆素為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長。

2.2 黃曲霉拮抗試驗

病原菌平板擴散法顯示初篩獲得的45株菌中有20株菌有抑菌圈。將抑菌圈的大小作為抑菌能力強弱的評判標準，通過量取透明圈的直徑，共得到拮抗活性較高的菌株11株，如表1所示。

Gonzalez等（2008）報道，玉米青貯前的霉菌含量超過了10⁴ cfu/mL，其中，污染類型以曲霉屬為主，這與Keller等（2012）研究青貯飼料樣品中霉菌污染情況一致。目前黃曲霉毒素對食品和飼料危害極其嚴重，然而在去除方法中，物理、化學脫毒的方法存在營養(yǎng)成分流失，脫毒不徹底的缺點。本研究采用微生物法，不僅避免了這些缺點，而且條件溫和、安全環(huán)保，國內(nèi)外研究表明微生物脫毒法擁有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。

由于黃曲霉毒素毒性較大，若直接用于篩選菌株，可能會威脅到人體的健康，而且黃曲霉毒素價格也相對較貴，所以本試驗采用與其結(jié)構(gòu)相似的香豆素為唯一碳源進行菌株的初篩。相比而言，香豆素的毒性較低，價格較低廉。李超波等（2012）利用此法篩選到10株能夠在香豆素平板上正常生長的降解黃曲霉毒素的菌株，戴軍等（2014）利用此法篩選得到27株高效降解毒素的菌株。所以香豆素作為初篩底物來篩選降解黃曲霉毒素的菌株，不僅毒性大大減弱，而且方便準確。

近年來已有利用黑曲霉（李冰等，2012）、枯草芽孢桿菌（孫玲玉，2014）、施氏假單胞菌F4（李超波等，2012）降解黃曲霉毒素的報道，但是降解率大多都集中在85%左右。本研究篩選到的菌株N-1a對黃曲霉毒素的降解率達到95%，優(yōu)于先前其他研究。本試驗菌株N-1a經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌，為國家飼料添加劑目錄中的安全菌株，并且該菌株還具有對黃曲霉的拮抗活性，應(yīng)用于青貯時可以達到對黃曲霉毒素防治結(jié)合的效果。

品質(zhì)好的青貯玉米在青貯過程中pH會降低到4.0以下，北方地區(qū)進行玉米青貯時，秋季溫度會低于20℃，故青貯菌株應(yīng)具有耐低pH、耐高低溫的性質(zhì)。本試驗篩選菌株N-1a在pH3.5及溫度為17℃和47℃時生長情況均良好，是一株潛在的微生物青貯菌劑。