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豬腸道內(nèi)棲息著大量微生物。這些微生物菌群的組成與結(jié)構(gòu)直接影響到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和宿主健康。在正常情況下、豬腸道微生物群落的組成相對(duì)恒定，但在其遇到日糧、疾病及溫度的巨大變化時(shí)，豬消化道微生物群落的平衡會(huì)被打破，其生產(chǎn)性能也隨之受到影響。研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期母豬由于激素等內(nèi)分泌因子的變化，常引發(fā)腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)紊亂。誘發(fā)便秘，對(duì)母豬生產(chǎn)性能造成極大負(fù)面影響。因此，如何改善妊娠母豬腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)與組成、防止便秘的發(fā)生，已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。

1    材料與方法

1．1    試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取2～3胎次的妊娠85d左右的健康經(jīng)產(chǎn)母豬16頭，隨機(jī)分為2組，每組8頭，分別為常規(guī)飼料組(對(duì)照組)和發(fā)酵飼料組(試驗(yàn)組)。妊娠后期的日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。發(fā)酵飼料的制作程序如下：采用保存于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院消化道微生物實(shí)驗(yàn)室的唾液乳桿菌L79、枯草芽孢桿菌B1121和釀酒酵母菌S1145制備菌液。并按質(zhì)量比2：2：1進(jìn)行混合(復(fù)合菌的總數(shù)量約為1× 109cfu／g)，取對(duì)照組常規(guī)飼料，按2 g／kg復(fù)合菌液添加于飼料底物中．調(diào)節(jié)飼料濕度為40％，混合均勻后分裝至單通閥發(fā)酵袋中，于37℃發(fā)酵2d?；?組所喂飼料的干物質(zhì)量相同的基礎(chǔ)上。飼喂前以6％的比例與常規(guī)飼料混合，將混合飼料作為試驗(yàn)組日糧。試驗(yàn)期間，每日飼喂2次．自由采食和飲水。試驗(yàn)期從妊娠85d開始。期間記錄母豬的產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)和初生仔豬的重量。

1．2    糞樣的采集與制備

在妊娠105 d，采集各組的新鮮糞便樣品，取部分糞樣按質(zhì)量比1：1與去離子水混合，5000g離心10min后，部分上清液凍置于-20℃冰箱中，用于乳酸濃度的測(cè)定，另一部分上清液中以5：1的比例加入25％(W／V)偏磷酸與巴豆酸混合液，混勻后凍存于-20℃冰箱中過夜用于揮發(fā)性脂肪酸濃度的測(cè)定；取部分樣品于-20℃保存，用于細(xì)菌DNA提取。

1．3    糞便樣品中乳酸和揮發(fā)性脂肪酸的測(cè)定

乳酸含量采用乳酸測(cè)試盒(A019—2．南京某生物工程研究所)測(cè)定。測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸的樣品解凍后，4℃、10000 g離心10min，于GC一14B型氣相色譜儀(Shimadzu)測(cè)定含量，具體方法參照文獻(xiàn)。

1．4    糞便樣品DNA的提取

糞便樣品DNA采用QIAamp Fast DNA Stool MiniKit(Qiagen)提取。稱取0．25 g糞便樣品置于鋯珠管中，與1mLInhibit Ex緩沖液及0.1g鋯珠(直徑0.1毫米)混勻，采用Mini-Beadbeater-1(BiospecProducts Inc)以4800r／min的速度混合20s，重復(fù)3次。將混合物于95℃的水浴鍋中水浴5min。水浴后的混合物離心1min，取上清液置于新的1.5mL離心管中，并加入15mL蛋白酶K。在Nanodrop 1000 spectrophotometer(Thermo Fishercientific)上測(cè)定DNA濃度及純度。

1．5    糞便微生物lllumina MiSeq測(cè)序

在IIIumina(MiSeq)平臺(tái)進(jìn)行DNA雙端測(cè)序。使用細(xì)菌16S rRNA基因的V3-V4區(qū)作為模板．進(jìn)行PCR擴(kuò)增．引物序列為341F(5’-barcode—CCTA．YGGGRBGCASCAG-3’)和806R(5’-barcode—GGACTACCVGGGTATCTAAT-3’)。擴(kuò)增條件為：95℃2 min；95℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。測(cè)序得到的序列通過QIIME(v．1．8．0)軟件進(jìn)行分析。將不含樣品信息的序列、過短或過長(zhǎng)的序列、出現(xiàn)ambiguous堿基及含有過多homologous堿基的序列去除。在97％的相似度水平上利用UPARSE對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行OTU歸類操作。利用稀疏曲線評(píng)價(jià)樣品的覆蓋率和取樣深度：使用Alpha多樣性指數(shù)：ACE、Chao、Shannon和Simpson進(jìn)行單樣本的多樣性分析：利用未加權(quán)的PCoA計(jì)算樣本間的差異性。

1．6    統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)經(jīng)Excel(2010)初步處理后，常規(guī)數(shù)據(jù)采用SPSS 20．0軟件中的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析，高通量測(cè)序結(jié)果采用Kruskal—WaIIis進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。顯著性水平(P值)置于0．05。

2   結(jié)果與分析

2．1   母豬的生產(chǎn)性能

如表2所示，與對(duì)照組相比，飼喂發(fā)酵飼料對(duì)母豬的總產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)和平均初生重?zé)o顯著影響(P>0.05)。

2．2   母豬糞便樣品的發(fā)酵參數(shù)

糞便的乳酸及揮發(fā)性脂肪酸的含量如表3所示。與對(duì)照組相比，飼喂發(fā)酵飼料對(duì)糞便中的乳酸和丙酸含量無顯著影響(P>0．05)。與對(duì)照組相比，飼喂發(fā)酵飼料顯著提高了糞便中乙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和戊酸的含量(P<0.05)。

2．3   母豬糞便微生物菌群的豐富度和多樣性的變化

稀疏曲線結(jié)果顯示，各樣品中的微生物的稀疏曲線趨于平緩，說明取樣合理，測(cè)序深度足以反映檢測(cè)樣品的菌群多樣性(圖1A)。主坐標(biāo)分析結(jié)果顯示，2組樣品無法明顯區(qū)分開，說明2組間的微生物菌群存在一定的相似性(圖1B)。如表4所示，與對(duì)照組相比，飼喂發(fā)酵飼料對(duì)母豬糞便微生物的OTU數(shù)、ACE、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均無顯著影響(P>0.05)。

2．4   母豬糞便細(xì)菌菌群組成的變化

在門水平上，糞便樣品共檢測(cè)到19個(gè)菌門。2組的優(yōu)勢(shì)菌門均為Bacteroidetes、Firmicutes和Spirochaetae，占糞便細(xì)菌菌群組成的91％以上。如表5所示，與對(duì)照組相比，飼喂發(fā)酵飼料顯著降低了Fibrobacteres的相對(duì)豐度(P<0.05)。在屬水平上．共檢測(cè)到262個(gè)屬，其中有20個(gè)菌屬的相對(duì)豐度大于1％。這20個(gè)屬的分析結(jié)果在表6展示。與對(duì)照組相比，飼喂發(fā)酵飼料顯著降低了Oscillospira和Fibrobacter的相對(duì)豐度(P<0.05)，有提高Blautia和Bacteroides相對(duì)豐度的趨勢(shì)(P<0.1)。

3    討  論

發(fā)酵飼料作為一類新型飼料，其在仔豬生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，仔豬日糧中添加發(fā)酵飼料，可顯著提高斷奶仔豬的成活率和平均斷奶重，降低哺乳仔豬的腹瀉率，從而提高母豬的生產(chǎn)性能。但目前有關(guān)發(fā)酵飼料對(duì)母豬生產(chǎn)性能的影響的報(bào)道較少，本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂發(fā)酵飼料對(duì)母豬產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)以及仔豬初生重?zé)o顯著影響．結(jié)果說明母豬窩產(chǎn)仔數(shù)等生產(chǎn)性能指標(biāo)更易受妊娠早期胚胎存活率的影響。

豬腸道微生物主要棲息于消化道后段．胃和小腸未消化吸收的營(yíng)養(yǎng)素進(jìn)入后腸，經(jīng)微生物發(fā)酵，產(chǎn)生大量發(fā)酵產(chǎn)物，進(jìn)而可被機(jī)體吸收。發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)入機(jī)體可起到供能及調(diào)控宿主代謝與免疫的作用。本試驗(yàn)中，飼喂發(fā)酵飼料顯著提高了糞便中乙酸和丁酸的含量。在這些揮發(fā)性脂肪酸中．乙酸可作為肝臟和外周組織的能量來源．也可作為糖原異生和脂肪生成代謝途徑中的信號(hào)分子。丁酸是結(jié)腸細(xì)胞的主要能量來源．可以預(yù)防炎癥，同時(shí)其還可抑制腸道內(nèi)的病原菌或腐敗菌生長(zhǎng)，促進(jìn)益生菌的生長(zhǎng)和增殖。有研究發(fā)現(xiàn)，丁酸在腸上皮細(xì)胞凋亡和增殖的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。本研究表明，飼喂發(fā)酵飼料促進(jìn)了母豬腸道微生物發(fā)酵，提高了糞便中揮發(fā)性脂肪酸的含量，因而對(duì)改善母豬腸道健康具有重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂發(fā)酵飼料影響了母豬腸道微生物菌群的組成。與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組母豬糞便中的Oscillospira和Fibrobacter屬的微生物的相對(duì)豐度顯著降低，Blautia和Bacteroides的相對(duì)豐度有升高的趨勢(shì)。Blautia是結(jié)腸中存在的一種產(chǎn)乙酸菌，其豐度的升高與糞便中乙酸含量升高相一致。Bacteroides是腸道中普遍存在的一種菌，據(jù)報(bào)道，Bacteroides屬微生物可以消化一些宿主難以消化的多糖，從而為機(jī)體供能。最近有研究表明，飼喂微生物發(fā)酵飼料增加了斷奶仔豬腸道菌群中的Bacteroides屬微生物的比例。該結(jié)果也與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致。Fibrobacter是一類纖維降解菌．其具有高纖維素分解活性．并且能夠降解難降解的植物結(jié)構(gòu)多糖。Fibrobacter在試驗(yàn)組含量降低的原因可能是由于飼料經(jīng)過益生菌發(fā)酵后，纖維素的含量降低，殘留的纖維素被其他纖維降解菌分解所致。Oscillospira是結(jié)腸中一種常見菌，生長(zhǎng)緩慢，有研究指出，這種緩慢生長(zhǎng)關(guān)系著結(jié)腸的蠕動(dòng)，并與便秘發(fā)生與否成正相關(guān)。本試驗(yàn)中，飼喂發(fā)酵飼料導(dǎo)致Oscillospira屬微生物的豐度下降，暗示發(fā)酵飼料可能有利于降低母豬便秘的發(fā)生，從而有益于腸道健康。

4   結(jié)  論

綜上所述，飼喂發(fā)酵飼料可以平衡母豬腸道微生態(tài)，對(duì)腸道健康有益生作用，但對(duì)母豬的產(chǎn)仔性能未產(chǎn)生顯著影響。 

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