高溫固態(tài)發(fā)酵制備豆粕多肽飼料中試試驗(yàn)探究
摘要：研究運(yùn)用自主開(kāi)發(fā)的一套高溫發(fā)酵技術(shù)，采用實(shí)驗(yàn)室篩選馴化的一株優(yōu)良高溫芽孢桿菌，配合自主研制的滾筒固態(tài)發(fā)酵設(shè)備，將800kg左右的豆粕與發(fā)酵種子液混合進(jìn)行高溫(55℃左右)固態(tài)發(fā)酵中試試驗(yàn)。結(jié)果表明:在發(fā)酵15h左右高溫發(fā)酵豆粕多肽含量提高近1倍，發(fā)酵52h時(shí)粗蛋白含量提高5.90%，發(fā)酵后豆粕的尿素酶活性明顯降低16種氨基酸的含量均有不同程度的升高。試驗(yàn)證明使用該高溫固態(tài)發(fā)酵技術(shù)與滾筒固態(tài)發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行發(fā)酵豆粕工業(yè)化生產(chǎn)具有可行性與潛力。
豆粕是大豆提油后的副產(chǎn)品，豆粕中存在多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，影響機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收。在微生物發(fā)酵過(guò)程中，微生物能產(chǎn)生水解酶消除豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，且能提高豆粕內(nèi)多肽含量，提高動(dòng)物消化吸收水平;此外，微生物發(fā)酵產(chǎn)生的益生菌對(duì)動(dòng)物腸道改善、降低抗生素使用等方面均有顯著效果。因此，對(duì)豆粕進(jìn)行微生物發(fā)酵制備發(fā)酵豆粕成為近些年飼料行業(yè)研究的熱點(diǎn)，固態(tài)發(fā)酵是目前生產(chǎn)發(fā)酵豆粕的主要方式。在實(shí)際生產(chǎn)中，一般將制備的發(fā)酵劑通過(guò)常規(guī)飼料混合裝置與發(fā)酵物料、培養(yǎng)基、水等輔料進(jìn)行混合，保持發(fā)酵所需條件進(jìn)行發(fā)酵，但該發(fā)酵過(guò)程消耗大量能量?，F(xiàn)代固態(tài)發(fā)酵一般是中低溫發(fā)酵，發(fā)酵溫度一般在36℃左右，但在這個(gè)溫度范圍豆粕自帶的原生菌也會(huì)隨著生長(zhǎng)，影響整個(gè)發(fā)酵效果，而且大批量固態(tài)發(fā)酵設(shè)備發(fā)展相對(duì)滯后，發(fā)酵設(shè)備需要進(jìn)一步升級(jí)才能與發(fā)酵工藝技術(shù)相匹配。本文的中試試驗(yàn)選用高溫菌株進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度50～65℃，在發(fā)酵過(guò)程中可抑制部分中低溫原生菌的生長(zhǎng)，減少干擾，達(dá)到更好的發(fā)酵效果。該固態(tài)發(fā)酵技術(shù)原料跳過(guò)滅菌步驟，可以節(jié)省成本與能耗，配合自主研制的中試發(fā)酵設(shè)備，可方便而快捷地實(shí)施豆粕固態(tài)發(fā)酵，為高溫菌株進(jìn)行豆粕高溫固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化、實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供實(shí)際參考。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
發(fā)酵菌株(高溫芽孢桿菌)，實(shí)驗(yàn)室篩選;豆粕，中儲(chǔ)糧鎮(zhèn)江糧油有限公司。
培養(yǎng)基:胰蛋白胨1.5%、大豆蛋白胨0.5%、氯化鈉0.5%。氫氧化鈉、碳酸鈉、酒石酸鉀及硫酸銅，分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。
高壓滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;
超凈工作臺(tái)，上海博迅實(shí)驗(yàn)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;
數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器，常州普天儀器制造有限公司;
300L液體發(fā)酵罐，常州新區(qū)三環(huán)生物工程成套設(shè)備有限公司;
滾筒固態(tài)發(fā)酵罐，自主研制;
凱氏定氮儀，丹麥FOSS公司;氨基酸自動(dòng)分析儀，日立儀器(上海)有限公司;
高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 基礎(chǔ)種子液制備
超凈工作臺(tái)預(yù)先殺菌30min，關(guān)閉紫外燈后，在酒精燈下分別挑取1環(huán)高溫菌株接入7瓶300mL無(wú)菌培養(yǎng)基中，于55℃搖床中活化培養(yǎng)14～18h，制得一級(jí)發(fā)酵種子液。
1.2.2 中試發(fā)酵種子液制備
300L液體發(fā)酵罐經(jīng)空消后，加入200L無(wú)菌液體培養(yǎng)基，再倒入1.2.1制得的7瓶一級(jí)發(fā)酵種子液(2100mL)，(55±0.5)℃發(fā)酵14～18h，得到二級(jí)發(fā)酵種子液。
1.2.3 混合菌液制備
將制備的二級(jí)發(fā)酵種子液加入提前加熱到70℃的800L熱水中，制得約1000L的混合菌液。
1.2.4 豆粕與發(fā)酵液的混合發(fā)酵
按照豆粕與混合菌液質(zhì)量比1∶1.25計(jì)算，加入豆粕量800kg左右。將混合菌液和豆粕按一定的進(jìn)料速度同時(shí)加至滾筒固態(tài)發(fā)酵罐(簡(jiǎn)稱(chēng)發(fā)酵滾筒)中，混合料溫度在 55℃左右，待物料全部加入到滾筒內(nèi)，開(kāi)啟加熱，每隔30min旋轉(zhuǎn)兩周，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。
1.2.5 豆粕發(fā)酵過(guò)程中溫度變化監(jiān)測(cè)
根據(jù)發(fā)酵滾筒中部及尾部卸料口處設(shè)置的兩個(gè)實(shí)時(shí)溫濕度傳感器記錄溫度變化。
1.2.6 樣品干燥
從料液完全進(jìn)入發(fā)酵滾筒開(kāi)始計(jì)時(shí)，約每4h取樣2kg，將所取樣品放入65℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎待測(cè)。
1.2.7 樣品檢測(cè)
粗蛋白測(cè)定采用GB/T 6432—2018中的方法;粗纖維測(cè)定采用GB/T 6434—2006的方法;粗灰分測(cè)定采用GB/T 6438—2007的方法;KOH蛋白質(zhì)溶解度測(cè)定采用GB/T 19541—2017的方法;胰蛋白酶抑制因子的測(cè)定采用ELISA方法;尿素酶活性測(cè)定采用GB/T 8622—2006的方法;氨基酸的測(cè)定采用GB/T 18246—2000的方法;有機(jī)酸含量的測(cè)定采用GB/T 23877—2009的方法。多肽含量檢測(cè):取2.5g粉碎后的豆粕加入蒸餾水，定容至100mL，攪拌30min后4000r/min離心15min。用蒸餾水將離心后的原液稀釋至合適倍數(shù)，取2mL混入等體積10%三氯乙酸溶液，混勻后靜置10min，于10000r/min離心10min。取1mL上清液與5mL堿性銅試劑混勻后快速加入0.5mL福林酚試劑，于30℃下保溫30min，于680nm下測(cè)定吸光值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.0024x+0.0307(R2=0.9981)，計(jì)算多肽含量。
1.2.8 數(shù)據(jù)分析
檢測(cè)數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS19.0軟件進(jìn)行顯著性分析，采用單因素方差分析檢驗(yàn)組間差異顯著性，采用Duncan 法進(jìn)行多重比較，顯著性水平為P＜0.05，并用 Origin 8.0進(jìn)行作圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 發(fā)酵滾筒中部及卸料口溫度變化(見(jiàn)圖1)
所研制設(shè)備加熱方式是以翅片式加熱管通入高壓蒸汽進(jìn)行加熱，以熱風(fēng)機(jī)將滾筒前部熱空氣吹到后部進(jìn)行加熱。發(fā)酵滾筒長(zhǎng)度為9m，直徑為2m，翅片式加熱管長(zhǎng)度為3m，在加熱過(guò)程中會(huì)造成發(fā)酵滾筒內(nèi)局部受熱不均的現(xiàn)象，特別是尾部卸料口的溫度一直低于前、中部溫度。由圖1可見(jiàn):固定蒸汽通入量，在0～15h發(fā)酵滾筒中部溫度一直處于不斷增長(zhǎng)的趨勢(shì)，可能是物料發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的熱量使溫度上升和外來(lái)熱源加熱共同作用結(jié)果;發(fā)酵15～40h滾筒中部溫度基本在50～60℃區(qū)間內(nèi)，發(fā)酵45h以后溫度又開(kāi)始上升，此時(shí)高溫發(fā)酵菌種活力變?nèi)?，可能是其他雜菌變成優(yōu)勢(shì)菌種開(kāi)始生長(zhǎng)產(chǎn)生熱量。卸料口溫度變化趨勢(shì)與滾筒中部溫度整體相似。
2.2 高溫固態(tài)發(fā)酵對(duì)豆粕中粗蛋白、粗灰分、粗纖維含量變化的影響(見(jiàn)圖2)
由圖2可知:豆粕發(fā)酵后其粗蛋白含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，未發(fā)酵時(shí)粗蛋白含量為50.55%，發(fā)酵52h粗蛋白含量增長(zhǎng)到53.53%，增長(zhǎng)率達(dá)5.90%，原因一是高溫菌株在發(fā)酵過(guò)程中，利用發(fā)酵種子液中的培養(yǎng)基，產(chǎn)生一些菌絲蛋白，二是物料中部分有機(jī)物在發(fā)酵過(guò)程中以無(wú)機(jī)氣體的形式揮發(fā)，使得干基粗蛋白含量相對(duì)上升;發(fā)酵后豆粕中粗纖維含量明顯下降，發(fā)酵15h時(shí)其含量由未發(fā)酵前的10%降低到4.53%，說(shuō)明該高溫菌株對(duì)粗纖維有一定的分解作用;發(fā)酵前后豆粕中粗灰分含量保持在7%～8%，變化范圍不大。
2.3 高溫固態(tài)發(fā)酵對(duì)豆粕 KOH 蛋白質(zhì)溶解度變化的影響(見(jiàn)圖3)
由圖3可知，發(fā)酵15h時(shí)豆粕受溫度影響，KOH蛋白質(zhì)溶解度從82%降低到 61%，蛋白質(zhì)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生變性，但隨后發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)到25h時(shí) KOH 蛋白質(zhì)溶解度恢復(fù)到83.1%，發(fā)酵時(shí)間到52h時(shí) KOH 蛋白質(zhì)溶解度又逐漸降低到77%左右，可能該高溫發(fā)酵菌種對(duì)蛋白質(zhì)的變性程度有一定的改善作用。
2.4 高溫固態(tài)發(fā)酵對(duì)豆粕胰蛋白酶抑制因子變化的影響(見(jiàn)圖4)
一般認(rèn)為胰蛋白酶抑制因子含量和尿素酶含量呈正相關(guān)關(guān)系，且豆粕中胰蛋白酶抑制因子和尿素酶活性含量變化的程度是一致的。由圖4可知，發(fā)酵后豆粕中胰蛋白酶抑制因子含量變化不顯著。
2.5 高溫固態(tài)發(fā)酵對(duì)豆粕尿素酶活性變化的影響(見(jiàn)圖5)
由圖5可知，尿素酶活性隨豆粕高溫發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸顯著降低，從0.03U/g降低到0.002U/g左右。尿素酶活性變化比胰蛋白酶抑制因子的變化明顯，且胰蛋白酶抑制因子含量的測(cè)定方法比較煩瑣，建議用尿素酶活性表征豆粕的抗?fàn)I養(yǎng)因子。高溫固態(tài)發(fā)酵確實(shí)對(duì)豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子有顯著的降低作用。
2.6 高溫固態(tài)發(fā)酵對(duì)豆粕中有機(jī)酸含量變化的影響(見(jiàn)圖6)
豆粕經(jīng)高溫發(fā)酵后能產(chǎn)生多種有機(jī)酸，其中乳酸含量最高。由圖6可知，乳酸含量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)不斷增加，豆粕發(fā)酵52h時(shí)乳酸含量可達(dá)4.49g/kg，且有持續(xù)上漲趨勢(shì)，低于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模發(fā)酵試驗(yàn)的(22.58g/kg)。本中試規(guī)模發(fā)酵與實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵所制造的環(huán)境條件存在差異，尚不能達(dá)到此含量，但是在增大發(fā)酵物料、減少發(fā)酵空間的條件下，實(shí)施二次優(yōu)化中試試驗(yàn)時(shí)，豆粕乳酸含量可以提高到15.69g/kg。
2.7 高溫固態(tài)發(fā)酵對(duì)豆粕多肽含量變化的影響(見(jiàn)圖7)
由圖7可知，采用發(fā)酵滾筒在高溫發(fā)酵菌種的作用下，豆粕多肽含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，發(fā)酵15h豆粕多肽含量從27.14mg/g增加到50.61mg/g，多肽含量最高可提高近1倍。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程中微生物分泌的蛋白酶分解大分子蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)被分解后生成小分子多肽。隨著發(fā)酵時(shí)間的持續(xù)延長(zhǎng)，多肽含量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，原因可能是發(fā)酵后期雜菌逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌株，部分不明雜菌分解掉部分肽，所以合理控制發(fā)酵時(shí)間是重要一環(huán)。該中試發(fā)酵豆粕產(chǎn)品中多肽含量低于實(shí)驗(yàn)室含量，因?yàn)樵摳邷匕l(fā)酵的最佳發(fā)酵溫度在55℃左右，目前該設(shè)備對(duì)溫度控制的穩(wěn)定性還有所欠缺，主要是發(fā)酵滾筒內(nèi)局部溫度不均勻(見(jiàn)圖1)，所以本試驗(yàn)控制發(fā)酵溫度是關(guān)鍵因素。
2.8 高溫固態(tài)發(fā)酵對(duì)豆粕中16種氨基酸含量變化的影響
不同發(fā)酵時(shí)間下豆粕中氨基酸含量變化情況如表1所示。
由表1可知，經(jīng)高溫發(fā)酵后豆粕中16種氨基酸含量基本均高于未發(fā)酵前豆粕中氨基酸的含量，發(fā)酵25h左右氨基酸含量較高。該中試發(fā)酵豆粕的氨基酸含量低于實(shí)驗(yàn)室的。
3 結(jié)論
采用特制發(fā)酵罐結(jié)合開(kāi)發(fā)的高溫固態(tài)發(fā)酵技術(shù)制得的高溫發(fā)酵豆粕多肽含量在發(fā)酵15h左右提高近1倍，發(fā)酵52h時(shí)豆粕中粗蛋白含量可提高5.90%，經(jīng)發(fā)酵后的豆粕尿素酶活性明顯降低，16種氨基酸含量均有不同程度的升高;對(duì)比NY/T 2218—2012《飼料原料發(fā)酵豆粕》，本方法制備的發(fā)酵豆粕粗蛋白、粗纖維、粗灰分、尿素酶活性均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求，在發(fā)酵15h時(shí)滿足賴(lài)氨酸含量不低于2.5%的要求。
該中試試驗(yàn)發(fā)酵豆粕中多肽含量、有機(jī)酸含量及氨基酸含量低于實(shí)驗(yàn)室的，中試規(guī)模試驗(yàn)未達(dá)到最佳發(fā)酵效果，主要原因是設(shè)備自身還存在不足，導(dǎo)致固態(tài)發(fā)酵溫度無(wú)法穩(wěn)定滿足最佳發(fā)酵溫度55℃左右，需要進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵設(shè)備的加熱保溫自動(dòng)化精確控制與發(fā)酵中后期酶活力不足的問(wèn)題;而且在樣品干燥過(guò)程中豆粕可能會(huì)進(jìn)行二次發(fā)酵，干燥過(guò)程中變化也還需進(jìn)一步研究;整體上中試試驗(yàn)證明，該高溫固態(tài)發(fā)酵技術(shù)配合自主研發(fā)的發(fā)酵設(shè)備在進(jìn)行非滅菌工藝發(fā)酵豆粕的擴(kuò)大生產(chǎn)上具有較高的可行性，發(fā)酵豆粕中多肽含量、粗蛋白含量、有機(jī)酸含量、氨基酸含量及 KOH 蛋白質(zhì)溶解度均有顯著性提高，尿素酶活性明顯降低;其耗氧發(fā)酵和非滅菌的發(fā)酵方式便捷且節(jié)能，有較大應(yīng)用潛力。
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