1.2 試驗材料與試劑

試驗期結(jié)束后采用無菌一次性塑料勺取直腸糞便樣品約5g，用無菌取樣袋封存后4℃冷藏，并及時運回實驗室進(jìn)行檢測。試驗動物在草原恒通食品有限公司進(jìn)行屠宰，宰后迅速測定肉品質(zhì)等相關(guān)指標(biāo)，同時取背最長肌約2g置于無菌無酶管于液氮中存放，并轉(zhuǎn)移到實驗室于-80℃冰箱中保存，用于抗氧化能力相關(guān)指標(biāo)以及基因的測定；另取背最長肌100g左右，在-20℃條件下冷凍，用于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定。

乳安邦內(nèi)蒙古和美科盛生物技術(shù)有限公司；總超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、CAT試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）試劑盒以及T-AOC試劑盒南京建成生物工程研究所；2,2-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)美國Amresco公司；RNAiso Plus、TBGreenTMPremix Ex TaqTM II、PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒大連寶生物工程大連有限公司；SYBR® Premix Ex TaqTM、Marker DL 2000大連寶生物工程有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

pH-STAR型胴體pH值直測儀德國 Matthaus；C-LM3B型數(shù)顯式肌肉嫩度儀 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)；TC-P2A全自動測色色差計 上海生物生化實驗儀器公司；Trace 1300、ISQ型GC-MS聯(lián)用儀 美國賽默飛世爾科技公司；SPME裝置 上海安譜實驗科技股份有限公司；XHF-DY型高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；TU-1810型紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；YNERGYH1型酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek Instruments公司；LightCycler®96實時熒光定量PCR儀 羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；BG-power3500型穩(wěn)定溫流電泳儀、水平電泳槽 北京百晶生物技術(shù)有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 生長性能的測定

試驗開始到試驗結(jié)束期間每月對試驗羊進(jìn)行空腹稱質(zhì)量，并進(jìn)行記錄。

1.4.2 腸道中乳酸菌和大腸桿菌的測定

在無菌條件下，取1g糞便到滅菌離心管中，加入9倍體積的生理鹽水，混勻后梯度稀釋，取1ml稀釋液接種到培養(yǎng)基后置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)（乳酸菌培養(yǎng)48h，大腸桿菌培養(yǎng)24h），最后進(jìn)行菌落計數(shù)，菌群數(shù)量以每克糞便中所含細(xì)菌群落總數(shù)的對數(shù)［lg(CFU/g)］表示。

1.4.3 肉品質(zhì)測定

羊屠宰后分別測定pH值（pH45min）、pH值（pH24h）、色差（L*值、a*值、b*值），嫩度及熟肉率。

1.4.4 揮發(fā)性成分提取

在20mL樣品瓶中加入5g肉糜，將老化的萃取頭插入樣品瓶使石英纖維頭暴露于樣品上部空間，在60℃條件下吸附45min后拔出，萃取頭在氣相色譜進(jìn)樣口，250℃解吸附4min。

GC-MS條件：TR-5毛細(xì)色譜柱（30m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣He；載氣流速1.0 mL/min；傳輸線溫度250℃；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣時間1min；升溫程序：40℃保持3min，以4 ℃/min升溫到150℃，保持1min，再以5 ℃/min升溫到200℃，最后以20 ℃/min升至230℃，保持5min進(jìn)樣口溫度250℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 30～400；溶劑延遲時間1.0min。

1.4.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)定性與定量

質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)與Meanlib、NISTDemo和Wiley Library檢索定性，將匹配度大于800作為鑒定依據(jù)，采用面積歸一化法計算各物質(zhì)峰面積百分含量。

1.4.6 關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)確定

采用ROAV法分析各揮發(fā)性物質(zhì)對羊肉風(fēng)味的貢獻(xiàn)。定義對樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的風(fēng)味物質(zhì)ROA Vstan=100，對其他風(fēng)味物質(zhì)有：

式中：Ci和Ti分別為各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對含量和感覺閾值；Cstan和Tstan分別為對樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對含量和感覺閾值。

1.4.7 抗氧化酶活力和T-AOC的測定

取0.5g肉樣于離心管中，加入9倍體積的生理鹽水，冰浴條件下勻漿30s（3000r/min），然后離心10min（4℃，4000r/min），取上清，參照南京建成生物工程研究所試劑盒的說明書測定SOD、CAT、GSH-Px以及T-AOC。

1.4.8 自由基清除率（RSA）的測定

參照羅玉龍等人的實驗方法測定RSA，抑制率計算公式如下：

注：式中A0為空白吸光度，A1為組織勻漿液吸光度。

1.4.9 抗氧化酶相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)量的測定

稱取約100mg的肉樣參照參考文獻(xiàn)進(jìn)行RNA的提取。提取的RNA測定吸光度（A260nm/A280nm）及濃度后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的RNA質(zhì)量，再將RNA樣品稀釋至500ng/μL，參照TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimerScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser）兩步法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將得到的cDNA放入-20℃冰箱內(nèi)保存。SOD、CAT、GPx由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成，18s作為管家基因，引物序列如表2。

動物腸道寄居著大量微生物，包括對動物機(jī)體有益的微生物（乳酸菌）以及有害的微生物（大腸桿菌），這些菌株間的數(shù)量組成被認(rèn)為是評價動物腸道健康的重要指標(biāo)。張乃鋒等人的研究結(jié)果表明在飼料中添加植物乳桿菌能夠顯著降低畜禽腸道中大腸桿菌數(shù)量，提高乳酸菌數(shù)量。本實驗的結(jié)果與其一致，日糧中添加乳酸菌的蘇尼特羊腸道中乳酸菌的含量顯著高于對照組（P＜0.05），大腸桿菌的數(shù)量顯著低于對照組（P＜0.05），其原因可能是畜禽攝入乳酸菌后在腸道中大量定殖，競爭性地爭奪腸壁的定殖位點。同時乳酸菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生乳酸及某些抑菌因子，抑制了大腸桿菌的數(shù)量，平衡了消化道微生物區(qū)系，這為動物的生長發(fā)育帶來積極影響。

2.2 日糧添加乳酸菌對蘇尼特羊生長性能的影響

在日糧中添加乳酸菌飼喂蘇尼特羊90d后，發(fā)現(xiàn)乳酸菌組的平均日增重顯著高于對照組（P＜0.05），這表明在飼糧中添加乳酸菌可提高肉羊的生長性能。Bayatkouhsar的試驗證明在日糧中添加乳酸桿菌可顯著提高犢牛的采食量和平均日增重。研究表明乳酸菌可產(chǎn)生黏附素定殖于腸黏膜表RT:面，這一過程使得動物胃腸道菌群處于動態(tài)平衡，此外乳酸菌在厭氧環(huán)境中可產(chǎn)生淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等，這些消化酶有助于畜禽對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而提高飼料的消化吸收率。

2.3 日糧添加乳酸菌對蘇尼特羊肉品質(zhì)的影響

由表5可知，乳酸菌組的初始pH值與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），經(jīng)排酸24小時后對照組的pH24值顯著高于乳酸菌組（P＜0.05）。對照組的剪切力顯著高于乳酸菌組（P＜0.05），說明日糧添加乳酸菌可改善蘇尼特羊肉的嫩度，使其更柔嫩多汁。這可能與乳酸菌參與機(jī)體脂肪代謝有關(guān)，乳酸菌可影響動物的脂肪代謝，使脂肪沉積在肌肉的內(nèi)肌束膜中，進(jìn)而使結(jié)締組織松散，最終提高了肌肉的嫩度。對照組與乳酸菌組的熟肉率無顯著差異（P＞0.05）。肉色是肌肉外觀評定的重要指標(biāo)，可以看出，乳酸菌組a*值高于對照組，L*值低于對照組，但差異不顯著（P＞0.05），乳酸菌組的b*值顯著低于對照組（P＜0.05），這表明乳酸菌對改善肉色有積極作用。肌肉組織的氧化導(dǎo)致高鐵肌紅蛋白的生成進(jìn)而使得肉色變差，而乳酸菌恰恰能夠阻礙該氧化進(jìn)程從而改善肉色。綜上，乳酸菌可能通過影響腸道中益生菌的數(shù)量、消化酶的水解活性以及與肉質(zhì)相關(guān)的糖酵解酶和原肌球蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響畜禽對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，最終改善肉品質(zhì)。

2.4 日糧添加乳酸菌對蘇尼特羊揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

羊肉中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，它是前體物質(zhì)經(jīng)脂質(zhì)氧化和美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的多種化合物共同作用形成的。據(jù)報道，羊肉的部分風(fēng)味物質(zhì)來源于菌群的代謝產(chǎn)物，由畜禽吸收并進(jìn)一步沉積到肌肉中。試驗共檢測出38種風(fēng)味物質(zhì)，其中，醛類物質(zhì)13種，主要物質(zhì)為己醛、庚醛和壬醛等；醇類13種，包括1-戊醇、正己醇、庚醇；烴類有5種，其中丁烷是最具代表性的物質(zhì)；酮類3種，其他物質(zhì)4種。兩組羊肉中，乳酸菌組中風(fēng)味物質(zhì)有29種，對照組中為26種，這表明日糧添加乳酸菌豐富了風(fēng)味物質(zhì)的種類。Wang等人在日糧中添加益生菌后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，益生菌組中風(fēng)味物質(zhì)的種類明顯增加。

閾值的高低決定了香味的濃郁程度，只有氣味閾值低的揮發(fā)性成分才能對風(fēng)味做出直接貢獻(xiàn)。通過揮發(fā)性成分的相對含量及閾值判斷，癸醛在蘇尼特羊肉中相對含量較高，且閾值為1 μg/kg，對蘇尼特羊肉的風(fēng)味貢獻(xiàn)最大，因此定義癸醛為兩組羊肉的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)（ROA Vstan=100）。當(dāng)ROAV≥1時，此揮發(fā)性成分為羊肉的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)；當(dāng)0.1≤ROAV＜1時，則對羊肉總體風(fēng)味有重要修飾作用。根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)的ROAV值共篩選出19種關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，其結(jié)果如表7所示。

醛類物質(zhì)主要來源于脂肪酸的氧化降解，其閾值較低，對風(fēng)味形成具有重要作用。己醛是不飽和脂肪酸的氧化產(chǎn)物，可作為兩組羊肉的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)（ROAV＞1），賦予羊肉獨特的青草味。庚醛、辛醛和壬醛在兩組羊肉的風(fēng)味中均是關(guān)鍵物質(zhì)（ROAV＞1），為羊肉提供脂香、花香和青草氣息。由表6可知，對照組庚醛、辛醛和壬醛的含量顯著高于乳酸菌組（P＜0.05），其原因可能是日糧添加乳酸菌提高了蘇尼特羊的抗氧化能力，從而降低了不飽和脂肪酸的氧化程度。羅玉龍的研究結(jié)果表明當(dāng)動物機(jī)體抗氧化能力較高時，其脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物庚醛、壬醛等含量明顯較低，這與本實驗的研究結(jié)果相符。戊醛和反-2-辛烯醛都可對對照組羊肉的風(fēng)味起到修飾作用（0.1＜ROAV＜1），但在乳酸菌組中未檢測到。癸醛的閾值較低，是蘇尼特羊肉中風(fēng)味貢獻(xiàn)度最大的物質(zhì)（ROAV＝100），由表6可知，對照組的相對含量顯著高于乳酸菌組（P＜0.05），這表明對照組羊肉有更濃的油脂味。這也說明飼糧中加入乳酸菌能有效抑制肉質(zhì)氧化。反-2-癸烯醛呈現(xiàn)清新的水果氣息，為蘇尼特羊肉帶來獨特風(fēng)味，兩組羊肉中反-2-癸烯醛的ROAV值都大于1，是具有重要修飾作用的風(fēng)味物質(zhì)。十一醛（花香、柑橘味）和十二醛（脂肪香、洋蔥、橙子味）僅在乳酸菌組中檢測到，說明日糧添加乳酸菌豐富了羊肉的風(fēng)味物質(zhì)種類，使羊肉的風(fēng)味更協(xié)調(diào)。

醇類主要由肌肉中的共軛亞油酸被脂肪氧合酶和氫過氧化酶降解產(chǎn)生。醇類閾值較高，對肉香的貢獻(xiàn)不如醛類，但也會左右風(fēng)味的形成。正己醇、1-戊醇和庚醇對羊肉風(fēng)味無明顯貢獻(xiàn)作用。1-辛醇和1-辛烯-3-醇僅在乳酸菌組中檢測到，前者提升了羊肉的堅果和黃油味，后者是亞油酸和花生四烯酸的氧化產(chǎn)物，在乳酸菌組中是關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)（ROAV＞1），其ROAV值達(dá)到77以上，賦予羊肉濃郁的蘑菇香和玫瑰氣味。

酮類化合物是脂肪氧化的另一種產(chǎn)物，由不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生。酮類對風(fēng)味的貢獻(xiàn)要小于醛類和醇類，但對羊肉的風(fēng)味形成具有不可替代的作用。二酮類化合物是美拉德反應(yīng)最初階段的產(chǎn)物，能為肉制品提供肉香和黃油香；3-羥基-2-丁酮對乳酸菌組羊肉具有重要修飾作用（0.1＜ROAV＜1）。

烴類可分為烷烴和芳香烴，對肉的風(fēng)味貢獻(xiàn)較小，但對肉的香味起到加和作用，其中有香味的烴為脂質(zhì)熱降解產(chǎn)生，也可在烷基自由基的脂質(zhì)氧化或類胡蘿卜素的分解中生成。苯酚呈現(xiàn)甜香氣味，僅在對照組中檢測到，且是對照組的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)（ROAV＞1）。

總體上，在蘇尼特羊飼糧中添加乳酸菌可改善羊肉風(fēng)味的種類和相對含量。對照組羊肉的特征風(fēng)味為油脂、青草和甜香氣味；乳酸菌組為鮮草、柑橘、洋蔥、玫瑰、花香、淡脂香和蘑菇香，因此日糧添加乳酸菌組豐富了羊肉的洋蔥、橙子、玫瑰和蘑菇氣味。

2.5 日糧添加乳酸菌對蘇尼特羊肉抗氧化能力的影響

動物機(jī)體抗氧化系統(tǒng)是保護(hù)自身免受氧化損傷的重要體系，與生物體的免疫力密切相關(guān)，包括酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)。其中SOD、CAT和GPx是肉中抗氧化酶系統(tǒng)的重要體現(xiàn)，T-AOC是反映機(jī)體抗氧化能力的綜合指標(biāo)，RSA則可反映肌肉抗氧系統(tǒng)對自由基的清除能力。

機(jī)體抗氧化酶會呈現(xiàn)發(fā)育性變化，但可能受到飼養(yǎng)方式、日糧組成等因素影響。本試驗中乳酸菌組CAT和T-AOC的活力顯著高于對照組（P＜0.05），GPx的活性高于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）。SOD和RSA在兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），整體上，乳酸菌組羊肉的抗氧化能力高于對照組。耿正穎等人在豬日糧中添加丁酸梭菌后發(fā)現(xiàn)GPx和T-AOC較對照組顯著提高。高暢的研究結(jié)果顯示日糧中添加乳酸菌可顯著提高育肥豬的SOD、GPx以及T-AOC的活性。這可能與乳酸菌的抗氧化能力有關(guān)，一方面，乳酸菌可通過清除自由基、螯合金屬離子而起到抗氧化作用，另一方面，乳酸菌在畜禽腸道內(nèi)停留時會通過代謝反應(yīng)向細(xì)胞壁外分泌胞外多糖和生物活性肽等物質(zhì)。這些代謝產(chǎn)物會發(fā)揮抗氧化作用，抑制脂質(zhì)自由基連鎖反應(yīng)的發(fā)生。因此，日糧添加乳酸菌可提高肌肉的抗氧化能力，從而抑制脂質(zhì)的過度氧化，減少不良風(fēng)味的產(chǎn)生，延長羊肉的貨架期。

2.6 日糧添加乳酸菌對蘇尼特羊抗氧化酶相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)量的影響

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