菌酶協(xié)同發(fā)酵豆粕工藝的優(yōu)化
豆粕因其富含蛋白質(zhì)，被廣泛應(yīng)用為飼用蛋白原料，但直接飼喂蛋白質(zhì)生物轉(zhuǎn)化率較低，而導(dǎo)致其轉(zhuǎn)化效率低的原因是在于抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在?？?fàn)I養(yǎng)因子不僅破壞了飼料本身的營養(yǎng)價值和可利用效率，還大大降低了家禽的生產(chǎn)性能。因此需要將豆粕中大分子蛋白轉(zhuǎn)變成肽類物質(zhì)和氨基酸等小分子物質(zhì)，進而提高飼料蛋白的利用率。酶解法和微生物發(fā)酵法是現(xiàn)在被廣泛用于處理豆粕的兩種方法。
酶解法利用蛋白酶將大分子蛋白分解為小分子物質(zhì)。其具有肽類物質(zhì)含量高、免疫活性強等特點，但在酶解過程易產(chǎn)生苦味物質(zhì)，影響飼料產(chǎn)品的適口性。微生物發(fā)酵法是通過發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶發(fā)揮作用，此外在發(fā)酵過程會產(chǎn)生大量有機酸及香味物質(zhì)，對于改善飼料適口性，調(diào)節(jié)動物腸道健康具備積極意義，但單一的微生物發(fā)酵法，蛋白酶的量較低，無法滿足實際生產(chǎn)需求。
菌酶協(xié)同發(fā)酵即在酶解工藝的處理下加入一定量的乳酸菌、酵母菌、芽孢菌、甚至霉菌等益生菌進行發(fā)酵，這些益生菌在發(fā)酵過程會產(chǎn)生多種香味物質(zhì)，可以對飼料產(chǎn)品的苦味起到調(diào)節(jié)作用。同時也可以克服單獨利用微生物發(fā)酵產(chǎn)酶不足的問題，這對于飼料的制備具有重大意義。而相較于其他益生菌，乳酸菌作為發(fā)酵菌種具有獨特的優(yōu)勢，它能夠利用飼料中的糖代謝生成乳酸及其他各種有機酸，降低飼料的pH值，從而發(fā)揮抑菌作用，延長飼料產(chǎn)品的保質(zhì)期，同時發(fā)酵產(chǎn)生的多種有機酸也增加了飼料的營養(yǎng)性和適口性。
本研究采取菌酶協(xié)同發(fā)酵法制備豆粕飼料。選用了產(chǎn)酸量高的植物乳桿菌作為發(fā)酵菌種，同時選用了堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶３ 種蛋白酶制劑對豆粕進行酶解，綜合考慮發(fā)酵豆粕的小肽含量和有機酸含量的變化情況，對菌酶協(xié)同發(fā)酵豆粕的工藝進行了優(yōu)化。
１ 材料與方法
1.1 菌株
植物乳桿菌DY6（CCTCC2017138）、副干酪乳桿菌DY2(CCTCC2017303)、鼠李糖乳桿菌DY4(CCTCC2017279)、乳酸片球菌DY5（(CCTCC2017280)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；植物乳桿菌DY1 和鼠李糖乳桿菌DY3， 為實驗室保藏。
1.2 主要試劑
乙酸鈉、K2HPO4、MgSO4 ·7H2O、MnSO4· ４H2O、檸檬酸三銨、豆粕、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶，購自山東和實集團有限公司；H2SO4、ZnSO4、CuSO4 、三氯乙酸、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒。
1.3 培養(yǎng)基
MRS培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10.0，牛肉膏8.0，酵母浸出粉4.0，葡萄糖20.0，K2HPO4 2.0，檸檬酸三銨 2.0，醋酸鈉 5.0，MnSO4· ４H2O 0.58，MnSO4· ４H2O 0.25吐溫-80 1ml，蒸餾水1 l，pH6.3~6.5，1×105Ｐa滅菌30min。
1.4 儀器與設(shè)備
SHP-300FE，智能生化培養(yǎng)箱上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；PL2002 電子天平，METTLER TOLIDO公司；5804Ｒ 冷凍離心機，德國Eppendorf公司；5424臺式高速離心機，德國Eppendorf公司；高效液相色譜儀chromaster，日本日立公司；GeIDoc凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司。
1.5 實驗方法
１.５.１ 菌株活化
將實驗室保藏菌種按照體積分?jǐn)?shù)為１％的接種量接種到MRS培養(yǎng)基，37 ℃活化24ｈ，按照同樣的方式活化2~3代，繼續(xù)于MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到乳酸菌的菌液。
１.５.２ 豆粕固態(tài)發(fā)酵
將風(fēng)干的豆粕、水、糖蜜、蛋白酶以及對數(shù)期的植物乳桿菌菌液按不同的的配比混合均勻后置于經(jīng)無菌處理的自封袋中，封口置于３7℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵48ｈ。
１.５.３ 發(fā)酵菌株的篩選
將風(fēng)干的豆粕、水、糖蜜、及對數(shù)期的乳酸菌菌液按（所述水的加入量占豆粕總質(zhì)量的50％、糖蜜原液的加入量占豆粕總質(zhì)量的3％、菌液接種量占豆粕總質(zhì)量的5％）比例混合均勻后置于無菌處理的自封袋中，37 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 ｈ。55℃烘干、粉碎，測定樣品中小肽、有機酸、總酸含量。
１.５.４ 蛋白酶的選擇
將風(fēng)干的豆粕、水、糖蜜、及不同的蛋白酶按（所述水的加入量占豆粕總質(zhì)量的５０％、糖蜜原液的加入量占豆粕總質(zhì)量的3％、蛋白酶加入量占豆粕總質(zhì)量的1％）比例混合均勻后置于無菌處理的自封袋中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48ｈ，55℃烘干、粉碎，測定樣品中小肽含量。
１.５.５ 菌酶協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化
１.５.５.１ 豆粕菌酶酵解的方法
將風(fēng)干的豆粕、水、糖蜜、蛋白酶及對數(shù)期的乳酸菌菌液按（所述水的加入量占豆粕總質(zhì)量的50％、糖蜜原液的加入量占豆粕總質(zhì)量的3％、菌液接種量占豆粕總質(zhì)量的5％、蛋白酶2500U/g）比例混合均勻后置于無菌處理的自封袋中，37 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵48ｈ。
１.５.５.２ 菌液接種量對發(fā)酵豆粕的影響
選取最佳菌株和蛋白酶，控制水、糖蜜及蛋白酶的添加量不變，分別接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％、2％、3％、4％、5％的菌液37 ℃發(fā)酵48ｈ，55℃烘干、粉碎，測定樣品中小肽含量和有機酸含量。
１.５.５.３ 加酶量對發(fā)酵豆粕的影響
控制水、糖蜜、及菌液的添加量不變，分別添加125、625、1250、1875、2500U/g 的蛋白酶37℃發(fā)酵48ｈ，55℃下烘干、粉碎，測定小肽含量和有機酸含量。
１.５.５.４ 發(fā)酵溫度對發(fā)酵豆粕影響
控制水、糖蜜、蛋白酶及菌液的添加量不變，分別設(shè)置發(fā)酵溫度為30、37、40、45 ℃，發(fā)酵48ｈ，55 ℃烘干、粉碎，測定小肽含量和有機酸含量。
１.５.５.５ 發(fā)酵時間對發(fā)酵豆粕影響
在基礎(chǔ)發(fā)酵條件上，控制其他因素不變，分別設(shè)定0、12、24、36、48、60、72 ｈ，經(jīng)烘干粉碎后測定小肽含量和有機酸含量。
１.５.６ 正交實驗
發(fā)酵工藝優(yōu)化采用4因素3水平正交試驗，共設(shè)9個處理，每個處理３ 個重復(fù)，選擇接種量、酶添加量、處理溫度和發(fā)酵時間4個因素進行正交試驗，因素水平見表1，經(jīng)烘干、粉碎后測定小肽含量和有機酸含量，隨后篩選出較優(yōu)組合。
１.５.７ 發(fā)酵豆粕指標(biāo)測定
１.５.７.１ 小肽含量的測定
采用方樂等的方法測定發(fā)酵前后豆粕的小肽含量。
１.５.７.２ 粗蛋白含量的測定
稱取1ｇ 豆粕樣品，0.2ｇ CuSO4，6ｇ K2SO4混合均勻放入消化管中，加入H2SO4１０ml，將消化管放到消化裝置上消化（420℃，2ｈ），將消化好的樣品用凱氏定氮儀測定。
１.５.７.３ 總酸含量的測定
發(fā)酵后的豆粕進行烘干粉碎，每55ｇ 樣品加50ｍＬ的去離子水，用旋渦振蕩儀振蕩15min，6000r／min離心５min，取10 ｍＬ 上清液，加入40 ｍＬ 蒸餾水，滴加3 滴酚酞指示劑，用標(biāo)定過的0.1 mol/Ｌ NaOH滴定至微紅。按公式(1)計算總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)L（折算成乳酸）：
式中：L，總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，％；c， NaOH溶液的濃度，mol/Ｌ；V，樣品滴定消耗的 NaOH體積，ｍＬ；V０ 空白滴定消耗的 NaOH體積，ｍＬ；90.08，乳酸的摩爾質(zhì)量，ｇ／mol；m，樣品質(zhì)量，ｇ。
１.５.７.４ 蛋白質(zhì)體外消化率的測定
采用李清曉等的方法測定發(fā)酵前后豆粕蛋白的體外消化率如公式(2)。
式中：D，蛋白質(zhì)體外消化率，％；m1未酶解粗蛋白質(zhì)量，ｇ；m2 酶解后粗蛋白質(zhì)量，ｇ。
１.５.７.５ 有機酸含量的測定
取1ｇ 豆粕于50ml 離心管中，加入10 ml去離子水，旋渦振蕩15min，10000r／min 離心５ min，取上清，經(jīng)0.22 μｍ 濾膜過濾后，進行液相檢測。
１.５.７.６ 豆粕大分子蛋白降解情況分析
稱取1ｇ豆粕并添加10 ml濃度為0.2 mol/Ｌ NaOH，混合均勻并攪拌15min，于10000r／min離心６min，吸取上清液１ml，稀釋10倍后作為樣品。取50μＬ 樣品液，加10μＬ蛋白上樣緩沖液，沸水?。祄in，12000r／min 離心５min，取上清10μＬ 上樣，分析豆粕大分子蛋白降解情況。
２ 結(jié)果與分析
2.1 發(fā)酵菌株的選擇
２.１.１ 小肽含量分析
豆粕經(jīng)過不同乳酸菌發(fā)酵后的小肽含量見圖１。
未經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的豆粕原料小肽含量為33.09ｍｇ/ｇ，由圖１可知，經(jīng)過不同菌株發(fā)酵后小肽含量都有所上升，其中經(jīng)副干酪乳桿菌DY２ 發(fā)酵后的豆粕中小肽含量為38.33ｍｇ/ｇ，經(jīng)植物乳桿菌DY6發(fā)酵后的豆粕中小肽含量為36.68 ｍｇ/ｇ，與對照組相比，小肽含量分別提高22.3％、18.5％。但總體來看，單純用乳酸菌發(fā)酵豆粕，小肽含量提高較少。
２.１.２ 有機酸含量分析
豆粕經(jīng)過不同乳酸菌發(fā)酵后的產(chǎn)酸情況見圖２，由圖可知經(jīng)不同菌株發(fā)酵后，植物乳桿菌DY6總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為2.3％，而飼料添加劑中，酸化劑的添加量一般在0.025％ ~3％，因此植物乳桿菌DY6優(yōu)異的產(chǎn)酸性能可以替代或者部分替代飼料中酸化劑的使用。另外，植物乳桿菌DY6 發(fā)酵產(chǎn)物中有機酸種類豐富，其中的乙酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸都具有改善飼料適口性和調(diào)節(jié)動物腸道菌群的作用。綜合其產(chǎn)酸情況和分解蛋白情況，選取植物乳桿菌DY6為發(fā)酵菌株。
2.2 蛋白酶的選擇
選用不同的蛋白酶在其合適的水解條件下處理豆粕，酶解后小肽含量見圖３。
豆粕經(jīng)蛋白酶處理后，小肽含量顯著提高，遠(yuǎn)高于單純利用乳酸菌發(fā)酵，其中利用中性蛋白酶處理后小肽含量最高，達104.25 ｍｇ/ｇ，比對照組小肽含量提高了215％，因此選取中性蛋白酶進行菌酶協(xié)同發(fā)酵。
2.3 菌酶協(xié)同發(fā)酵豆粕工藝探究
２.３.１ 菌液接種量對發(fā)酵豆粕的影響
菌液接種量對發(fā)酵豆粕的影響見圖4，小肽含量隨菌液接種量的上升而提高，在接種量為5％時趨于穩(wěn)定。其中乳酸、丙酸在接種量5％條件下含量最高，乙酸含量變化不明顯，而檸檬酸在接種量2％的條件下含量最高，綜合小肽含量和產(chǎn)酸情況，最終選取5％的接種量為最適菌液接種量。
２.３.２ 加酶量對發(fā)酵豆粕的影響
由圖5可知，當(dāng)加酶量小于1250Ｕ/ｇ 時，小肽含量隨加酶量的增加而提高，在加酶量為1250Ｕ/ｇ的時候小肽含量趨于穩(wěn)定。而在加酶量為1250Ｕ/ｇ時乳酸、丙酸含量最高分別達到了1.07ｍｇ/ｇ 和3.34ｍｇ/ｇ，另外檸檬酸、乙酸含量適中，同時考慮到成本因素，控制加酶量，選擇1250Ｕ/ｇ 為其最適加酶量。
２.３.３ 發(fā)酵溫度對發(fā)酵豆粕影響
如圖６ 所示，發(fā)酵溫度40℃條件下小肽含量最高，為109.78ｍｇ/ｇ，在35、37℃條件下小肽含量差別不大，可見40℃適合中性蛋白酶酶解，說明相對較高的溫度可使得中性蛋白酶的酶活增強。而有機酸含量在37℃最高，其中乳酸含量最高，符合植物乳桿菌在37℃生長最佳的情況。40℃的發(fā)酵溫度下，雖然小肽含量高，但其有機酸含量處于較低水平，因此綜合小肽含量和有機酸含量，確定最適發(fā)酵溫度37 ℃。
２.３.４ 發(fā)酵時間對發(fā)酵豆粕影響
由圖7 可知，在一定發(fā)酵時間內(nèi)，小肽含量隨發(fā)酵時間的增加而提高，發(fā)酵36ｈ后小肽含量達到108.71 ｍｇ／ｇ，36ｈ 之后，隨發(fā)酵時間的增加，小肽含量基本不變。4種有機酸含量隨著發(fā)酵時間的不斷增加而增加，發(fā)酵至36ｈ，檸檬酸、乙酸、丙酸的含量趨于穩(wěn)定，發(fā)酵４８ ｈ 乳酸含量較之前有顯著提高，并在發(fā)酵48ｈ 后各種有機酸含量也趨于穩(wěn)定。因此根據(jù)小肽含量和有機酸含量確定最適發(fā)酵時間為48ｈ，較好地控制了發(fā)酵時間，降低了成本。
2.4 正交實驗結(jié)果分析
以小肽含量和總酸含量為指標(biāo)，選取接種量、酶添加量、溫度和發(fā)酵時間，進行4因素3水平正交實驗，結(jié)果見表２。結(jié)果顯示，以小肽含量為指標(biāo)時，影響因素依次為發(fā)酵時間＞溫度＞接種量＞酶添加量。最優(yōu)條件為處理溫度40℃，接種量5％，酶添加量1250Ｕ/ｇ 發(fā)酵時間48ｈ。
以總酸含量為指標(biāo)，影響因素依次為溫度＞發(fā)酵時間＞接種量＞酶添加量。最優(yōu)條件為處理溫度37 ℃，發(fā)酵時間48ｈ，接種量5％，酶添加量1875Ｕ/ｇ通過兩者數(shù)據(jù)分析，酶添加量對小肽含量和總酸含量影響小，并考慮成本，所以選取酶添加量為1250Ｕ/ｇ，另外處理溫度對小肽含量和總酸含量影響較大，根據(jù)單因素和正交實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)在處理溫度為40℃時小肽含量最高但其總酸含量極低，而在37 ℃時小肽含量僅次于40℃，差距不大，而其產(chǎn)酸情況最佳，在兼具降解能力的同時提高了飼料的營養(yǎng)價值。最終確定的最佳發(fā)酵方案為：酶添加量1250Ｕ/ｇ，處理溫度37 ℃，接種量5％，發(fā)酵時間48ｈ。
2.5 蛋白降解情況分析
豆粕蛋白降解情況見圖８，由圖8可知，原豆粕中存在抗原蛋白，豆粕中抗原蛋白主要由７Ｓ 球蛋白和11S球蛋白組成，7S球蛋白中的α’、α、β亞基分子質(zhì)量分別為68、67 和57kDa，11大豆球蛋白的A３亞基、酸性亞基Ａ以及堿性亞基Ｂ的分子質(zhì)量分別為44、39和17kDa。由植物乳桿菌單獨進行發(fā)酵豆粕，豆粕中抗原蛋白未能得到有效降解，通過中性蛋白酶酶解和植物乳桿菌協(xié)同發(fā)酵豆粕，可以發(fā)現(xiàn)兩種抗原蛋白得到有效降解，其中7S 蛋白基本被完全降解，11S酸性亞基得到有效降解，且分子質(zhì)量小于31kDa的蛋白顯著增多，表明豆粕中的抗原蛋白得到有效降解，豆粕更易被吸收。
2.6 發(fā)酵豆粕指標(biāo)測定
發(fā)酵豆粕的各項測定結(jié)果見下表３，由表可知豆粕經(jīng)過3種方式處理，各項指標(biāo)均有所提高，其中菌酶協(xié)同發(fā)酵樣品的各項指標(biāo)提高最多。粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)由原來的46.87％提高到了53.10％。豆粕的肽含量最高達到了107.21ｍｇ/ｇ。而總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高到了2.50％。蛋白質(zhì)體外消化率由原來的51.95％提高到了69.8％。綜上所述，菌酶協(xié)同發(fā)酵豆粕優(yōu)于其他2種單獨處理豆粕的方式，它既能有效分解抗原蛋白，又能產(chǎn)生多種小分子酸，提高了飼料的適口性。通過酶解法酶解豆粕雖然可以有效分解大豆蛋白成為小肽，但在酶解過程會產(chǎn)生苦味。而菌酶協(xié)同在兼具有效降解蛋白的同時，通過乳酸菌產(chǎn)生的有機酸、香味物質(zhì)等可有效改善飼料的口味，降低苦味的影響。鄭裴等利用植物乳桿菌對豆粕進行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子得到降解，氨基酸含量趨于平衡，口感和色澤得到了較大改善。張煜等菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料后，有效降解了抗原蛋白，提高了乳酸含量，從而提高了飼料養(yǎng)分消化率。
３ 討論
豆粕常用的處理方式包括微生物發(fā)酵和蛋白酶處理，本研究采用菌酶協(xié)同發(fā)酵處理豆粕，既能夠很好地去除抗原蛋白又增加了飼料的適口性，本研究綜合考慮蛋白分解情況、產(chǎn)有機酸情況，以及發(fā)酵工藝成本，確定了工藝條件為：接種量5％，酶添加量1250Ｕ/ｇ，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時間48ｈ。菌酶協(xié)同發(fā)酵工藝處理豆粕，可有效降解豆粕中大分子蛋白，提高發(fā)酵豆粕的各項指標(biāo)，粗蛋白含量、肽含量、總酸含量、蛋白質(zhì)體外消化率這4個指標(biāo)都優(yōu)于通過乳酸菌或酶單獨處理的工藝，與未發(fā)酵豆粕相比，粗蛋白含量提高了6.23％，肽含量提高了223％，總酸含量提高了1.8％，蛋白質(zhì)體外消化率提高了17.85％。
據(jù)報道，通過蛋白酶分解豆粕蛋白可以得到分子質(zhì)量較小的肽類物質(zhì)，其中的一些成分還具有較好的免疫活性。常用的蛋白酶有酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶，風(fēng)味蛋白酶等。通過風(fēng)味蛋白酶酶解大豆分離蛋白，可以顯著提高其體外消化率，降低抗原蛋白的抗原活性。酸性蛋白酶和中性蛋白酶則因其價格便宜，且具有一定的脫苦作用，在飼料工業(yè)常作為酶解豆粕的酶制劑，但由于多肽自身結(jié)構(gòu)問題不可避免地會導(dǎo)致苦味的存在，大大影響產(chǎn)品的適口性。因此通過微生物發(fā)酵輔助酶解蛋白，不僅可以降低飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，還可以大大提高飼料的適口性。乳酸菌在微生物發(fā)酵過程中，可以提高發(fā)酵產(chǎn)品游離氨基酸的量，并產(chǎn)生葉酸，核黃素，有機酸，維生素等。另外其可以有效地抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長，提高機體的免疫力。菌酶協(xié)同工藝表現(xiàn)出了極大的優(yōu)勢，也成為了關(guān)注熱點。張煜等通過菌酶協(xié)同發(fā)酵顯著改善了玉米-豆粕飼料的品質(zhì)，并大大提高了豬的采食量。蔡國林等利用植物乳桿菌和蛋白酶發(fā)酵花生粕，大分子蛋白得到顯著降解，必需氨基酸得到提高，改善了花生粕的品質(zhì)。周爽等利用枯草芽孢桿菌和中性蛋白酶協(xié)同發(fā)酵豆粕，大大提高了其肽含量，提高了飼料的適口性?？梢钥闯?，菌酶協(xié)同處理能夠有效地提高飼料品質(zhì)，具有廣泛應(yīng)用前景。
目前對豆粕的固態(tài)發(fā)酵主要集中在單菌發(fā)酵和混菌發(fā)酵上，混菌發(fā)酵可以彌補單菌發(fā)酵的不足，有助于提高豆粕的營養(yǎng)和降低生長抑制因子，但混菌發(fā)酵控制精度要求高，菌株相互影響，發(fā)酵過程復(fù)雜。本研究主要集中在單菌發(fā)酵工藝的研究，后續(xù)可進行混菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化，此外，在酶的選擇上，也可進行多種酶復(fù)合作用的研究，從而篩選出更優(yōu)發(fā)酵工藝。
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