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菌渣廢棄物一般富含水分、易腐爛、不易保存，直接排放污染環(huán)境。隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展和人們生活水平日益提高，畜牧產(chǎn)品需求增大，致使飼料缺口逐年增加，出現(xiàn)了供求關(guān)系難以平衡的局面。因而，尋求新蛋白源成為飼料科學中的一項重要課題。目前，運用微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料越來越受重視。本研究探討不同基質(zhì)配比、不同溫度、不同料水比以及不同培養(yǎng)時間對酵母菌發(fā)酵蛋白質(zhì)含量的影響，并在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗法對菌渣固態(tài)發(fā)酵菌體蛋白飼料的工藝進行優(yōu)化。

1.1　材料

酵母菌、提取金頂側(cè)耳菌菇多糖后殘留菌渣、麩皮、馬鈴薯浸取液、葡萄糖、瓊脂粉、玉米粉、濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、40％ NaOH 溶液、HCI 溶液、混合滴指示劑（0.１％ 甲烯藍∶0.1％ 甲基紅＝1：4）。

1.2　方法

1.2.1 　基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備　

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：自制馬鈴薯浸取液1.0 Ｌ，加入瓊脂粉15.0 g，葡萄糖20.0 g，121 ℃滅菌25 min 后，取出斜面放置，冷卻備用。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：分別以菌渣、菌渣＋麩皮、菌渣＋玉米粉為培養(yǎng)基基質(zhì)，添加一定量的水分、配制成用于考察水料質(zhì)量比（簡稱水料比）、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)物蛋白含量影響的不同培養(yǎng)基，于121 ℃滅菌25min 。

1.2.2 　菌種的活化

在無菌條件下，將酵母菌種接種到PDA 斜面培養(yǎng)基上，放置恒溫箱內(nèi)，在30 ℃下恒溫培養(yǎng)，活化72ｈ，得到優(yōu)質(zhì)菌種。

1.2.3　液體種子培養(yǎng)

在無菌條件下，用10mL 無菌水沖洗斜面培養(yǎng)基上已活化的菌種，接種至盛有80mL 液體種子培養(yǎng)基的三角燒瓶中，置于搖床中，在30℃、160r/min的條件下振蕩培養(yǎng)72h。

1.2.4　固體發(fā)酵培養(yǎng)　

在無菌條件下，將酵母菌以13％ 的接種量接種到已滅菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于25 ～40 ℃恒溫箱中培養(yǎng)72ｈ。待培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)物置于50 ℃烘箱中風干，測粗蛋白質(zhì)含量?；A(chǔ)對照為未發(fā)酵樣品，將試驗所用的金頂側(cè)耳菌菇多糖提取后的殘渣在50 ℃條件下烘干，隨機稱取0.2g 未經(jīng)酵母菌發(fā)酵樣品，測定其蛋白質(zhì)含量。

1.2.5　粗蛋白質(zhì)含量的測定　

采用微量凱氏定氮法測定粗蛋白質(zhì)含量。將發(fā)酵好的培養(yǎng)基烘干至恒質(zhì)量，稱取0.2g烘干后的培養(yǎng)基，放入干燥的消化管中，再加入0.4g 的混合催化劑后，加入20mL的濃硫酸。待消化管中液體冷卻后，加入蒸餾水20mL進行蒸餾，在接收瓶中加入2％ H₃ BO₃ 50 ｍＬ和2 ～3 滴指示劑，用0.05 mol/Ｌ HCI 滴定接收瓶內(nèi)的溶液，滴定溶液由綠色變成淡紫色或灰色時為滴定終點，記下消耗HCI 的體積（mL），計算粗蛋白質(zhì)含量。

1.2.6 　正交試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L₉(3⁴)正交試驗法對基質(zhì)配比、溫度、水料比以及培養(yǎng)時間這4 個影響因素進行優(yōu)化，每組試驗重復(fù)3 次。

2結(jié)果與分析

本研究探討了不同基質(zhì)配比、不同溫度、不同水料比以及不同培養(yǎng)時間對酵母菌發(fā)酵蛋白質(zhì)含量的影響，并在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L₉(3⁴)正交試驗法對基質(zhì)配比、溫度、水料比以及培養(yǎng)時間4 個因素進行優(yōu)化。

2.1　不同基質(zhì)配比對粗蛋白含量的影響

優(yōu)化后的蛋白含量顯著高于未發(fā)酵樣品的蛋白含量（7.8%）。在1mL∶2.5g的水料比、13％ 接種量、30 ℃培養(yǎng)96h條件下，不同基質(zhì)配比所獲蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)顯著差異。當菌渣與麩皮以質(zhì)量比9：1 的比例混合時，粗蛋白質(zhì)含量可達最高值（18.3％），與純菌渣組和質(zhì)量比9：1 菌渣玉米粉組呈現(xiàn)顯著差異。這可能是因為在培養(yǎng)基的發(fā)酵體系中，麩皮含有較豐富的營養(yǎng)組分，其所含糖分、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等都是菌種發(fā)酵所必需的物質(zhì)。因此，添加麩皮有利于菌體生長。同時，麩皮質(zhì)地粗糙，能增強物料通透性，促進菌生長。添加玉米粉的培養(yǎng)基，粗蛋白質(zhì)含量增加不明顯，僅為12.1％，這可能是由于玉米粉顆粒較細，易使培養(yǎng)基黏性大、結(jié)塊、通透性差，從而不利于菌體生長。

2.2　不同溫度對粗蛋白含量的影響

在1mL：2.5g的水料比、13％接種量、菌渣和麩皮質(zhì)量比9：1、培養(yǎng)96h 的條件下，不同溫度下所獲蛋白質(zhì)含量呈顯著差異。蛋白質(zhì)含量隨溫度升高而增加，當溫度為30℃ 時，蛋白質(zhì)含量達最高值，30℃也是酵母菌體較為適宜的生長溫度。當溫度升至35℃時，蛋白質(zhì)含量開始隨溫度升高而降低，這可能是由于溫度過高，加快了發(fā)酵物的水分蒸發(fā)，造成了不利于菌體生長的環(huán)境，從而降低蛋白質(zhì)含量。

2.3　不同水料比對粗蛋白含量的影響

菌體的生長需要適宜的水分，固態(tài)發(fā)酵物料中的含水量是影響蛋白質(zhì)產(chǎn)量的重要因素之一。在菌渣和麩皮質(zhì)量比9：1、13％接種量、30℃培養(yǎng)96h 條件下，不同水料比會使蛋白質(zhì)含量呈顯著現(xiàn)差異。水料比為1mL∶1.0g 時，粗蛋白含量最低，僅有10.8％；當水料比為1mL：2.5g時，粗蛋白質(zhì)含量高達:17.7％；當水料比為1mL∶3.0g 時，粗蛋白量降低至15.3％。基質(zhì)水分過多，培養(yǎng)基易黏結(jié)，多孔性降低，通透性削弱，基質(zhì)易變質(zhì)，雜菌易污染；含水量過低，則會降低培養(yǎng)基的膨脹程度，妨礙菌體利用基質(zhì)營養(yǎng)，從而影響菌體生長，導致菌體生長不完全，蛋白質(zhì)含量低。

2.4　不同發(fā)酵時間對粗蛋白含量的影響

在1mL ∶2.5g 的水料比、菌渣和麩皮質(zhì)量比9：1、13％接種量、30℃培養(yǎng)條件下，不同發(fā)酵時間下蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)顯著差異。發(fā)酵初始，粗蛋白含量隨時間增加而增長，當發(fā)酵96ｈ 時粗蛋白含量高達17.6％；隨著發(fā)酵時間延長至120ｈ，蛋白質(zhì)含量降低至15.7％。由此可見，當發(fā)酵24ｈ 時，菌體沒有達到完全生長，隨著時間的延續(xù)，菌體逐漸成熟。在發(fā)酵96h 時，菌體生長最佳。發(fā)酵120ｈ 后，菌體有可能已經(jīng)完成了生長周期，表現(xiàn)出衰退或死亡的現(xiàn)象，并引起菌體的自溶現(xiàn)象，從而降低粗蛋白含量。

2.5　固態(tài)發(fā)酵條件的正交優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L₉(3⁴)正交試驗法對基質(zhì)配比、溫度、水料比以及培養(yǎng)時間這4個影響因素進行優(yōu)化，結(jié)果見表2。極差分析結(jié)果顯示，影響粗蛋白含量影響因素主次順序分別為基質(zhì)配比＞發(fā)酵時間＞溫度＞水料比；方差分析結(jié)果也顯示，基質(zhì)配比是影響粗蛋白含量的主要因素。固體發(fā)酵菌渣蛋白飼料工藝中的最優(yōu)組合為A₃ B₂ C₁ D₃ ，即在酵母菌接種量1％條件下，菌渣∶麩皮質(zhì)量比為8：2、水料比1 mL：2.5g、30℃下培養(yǎng)96h，發(fā)酵物的粗蛋白含量可達18.43％。