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乳酸菌為主的發(fā)酵劑發(fā)酵中藥在仔豬上的應(yīng)用效果好

2019-07-25 22:58:37      點擊:

化學(xué)合成類抗生素的推廣應(yīng)用帶動了畜牧業(yè)的迅猛發(fā)展,極大地推動了規(guī)模化養(yǎng)殖的進程,使養(yǎng)殖成本不斷降低。隨著市場上肉、禽、蛋、奶供過于求,人們逐漸反思化學(xué)合成類藥物飼料添加劑帶來的健康、環(huán)境等負面影響。有實驗證明長期使用或濫用抗菌素引發(fā)的耐藥菌生長和抗藥基因的轉(zhuǎn)移,可能導(dǎo)致人和動物機體免疫力下降、二次用藥增加、藥物殘留、雙重和內(nèi)源性感染等一系列問題,對健康構(gòu)成威脅。而有機酸、酶制劑、益生元、植物提取物和精油、以及微生態(tài)制劑等新型飼料添加劑可能成為抗生素等藥物飼料添加劑的替代品,從飼料源頭消除安全隱患。

一、中藥發(fā)酵

中藥發(fā)酵是利用微生物的生長代謝和生命活動來炮制中藥的一種藥物加工技術(shù),其本質(zhì)就是利用微生物在生長代謝過程中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物(酶和有機酸等),對外源性中藥底物進行結(jié)構(gòu)的修飾和轉(zhuǎn)化。

(一)中藥發(fā)酵的歷史

發(fā)酵作為傳統(tǒng)中藥炮制方法之一,應(yīng)用已有一千多年的歷史。它不但改變了煎、煮、熬、煉、蒸、浸等條件相對嚴苛的傳統(tǒng)工藝,而且使藥效提高、藥性發(fā)生改變。經(jīng)凈制或處理后的藥物,在相對溫和的溫度(30~37℃)和濕度(70%~80%)條件下,通過酵母、霉菌及酶等的作用,使藥物發(fā)泡、生衣的方法稱為發(fā)酵法。

(二)傳統(tǒng)中藥發(fā)酵的分類

1. 藥料與面粉混合發(fā)酵

如神曲。神曲為青篙、杏仁等藥加入面粉混合后,經(jīng)發(fā)酵制成曲劑,有消食化積、健脾胃等功效。

2. 藥料直接進行發(fā)酵

如紅曲。紅曲為紅曲霉屬真菌接種于蒸熟的大米上發(fā)酵而成,有健脾消食、活血化瘀的功效。

(三)傳統(tǒng)中藥發(fā)酵的優(yōu)缺點

1. 優(yōu)點

條件簡單溫和,原輔料多就地取材,真菌固體發(fā)酵為主,后處理烘干粉碎,易于保藏。

2. 缺點

(1)發(fā)酵菌種以真菌為主,相對單一,且自然條件下影響因素眾多,目的菌接種與雜菌難以控制;

(2)發(fā)酵培養(yǎng)基影響很大,不同物料組成會產(chǎn)生藥性藥效的差異,導(dǎo)致適應(yīng)證不同;

(3)發(fā)酵條件多憑經(jīng)驗感官把握,要想嚴格控制難度很大。主觀性大,產(chǎn)品穩(wěn)定性難以保證。

(四)現(xiàn)代中草藥發(fā)酵的優(yōu)點

1. 藥物有效成分活性物質(zhì)能最大限度地得以保留提取。

2. 嚴格發(fā)酵工藝控制,減少雜菌及有害產(chǎn)物的生成。

3. 產(chǎn)生新的有效活性物質(zhì),提升了藥效。

4. 降低藥物的毒副作用,改善適口性。

5. 提高利用價值,減少藥材浪費,降低使用成本。

二、植物劑與微生態(tài)制劑的組合

(一)中藥及益生菌拮抗產(chǎn)毒素大腸桿菌K88體外初篩試驗

分別利用19種中藥和8種益生菌進行藥敏試驗,結(jié)果顯示其中5種中藥及2種益生菌的抑菌效果較好,分別為烏梅、五倍子、黨參、石榴皮、蒲公英、植物乳桿菌0015和嗜酸乳桿菌0111。并進一步選擇中藥烏梅、五倍子、黨參、石榴皮、蒲公英及益生菌0015、0111作為后續(xù)動物體內(nèi)篩選試驗材料。

(二)中藥及益生菌小鼠模型復(fù)篩試驗

采用灌胃的方式給藥,并測定給藥小鼠的生理生化指標,來分析中藥組方是否影響乳酸菌生長及乳酸菌發(fā)酵是否引起中藥成分的變化。

1. 中藥組方對乳酸菌生長的影響

通過發(fā)酵前后乳酸菌數(shù)量的變化分析,表明中藥組方不影響乳酸菌生長。

2. 乳酸菌發(fā)酵對中藥成分的影響

單味中藥,如烏梅的有效成分主要是草酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸,蒲公英的有效成分主要是黃酮類(木犀草素、槲皮素)、酚酸類(綠原酸、咖啡酸、阿魏酸),五倍子的有效成分主要是鞣酸(單寧酸)和沒食子酸,而嗜酸乳桿菌的有效成分主要是乳酸、乙酸和草酸等有機酸。

(1)乳酸菌發(fā)酵對蒲公英中綠原酸、木犀草素成分的影響

中藥水提與中藥發(fā)酵中的游離木犀草素、綠原酸含量相差不大,基本無影響,且重復(fù)性較好。表明乳酸菌發(fā)酵未改變蒲公英中有效成分木犀草素、綠原酸的含量。

(2)乳酸菌發(fā)酵對蒲公英中綠原酸成分的影響

中藥水提和中藥發(fā)酵中綠原酸含量相差不大。乳酸菌發(fā)酵未改變蒲公英有效成分綠原酸的含量。

(3)乳酸菌發(fā)酵對蒲公英中有機酸成分的影響

發(fā)酵后部分成分發(fā)生變化,除蘋果酸含量有所降低外,各種有機酸均有不同程度的升高,其中檸檬酸和琥珀酸含量增加較多,分別為中藥水提的1.28和2.51倍。

(3)乳酸菌發(fā)酵對蒲公英中新出現(xiàn)的成分的影響

五倍子水提液在20min左右出現(xiàn)了峰,發(fā)酵前出現(xiàn)的較高未知峰來源于五倍子。五倍子中含有豐富的單寧酸。以單寧酸為對照品,進行高效液相色譜分析,分析圖譜可知,發(fā)酵前的未知峰為單寧酸。

隨發(fā)酵時間延長,發(fā)酵前后未知峰此消彼長,7-9h變化較快,發(fā)酵12h后,發(fā)酵前峰降到最低,發(fā)酵后峰達到最高。說明發(fā)酵前后未知峰存在某種轉(zhuǎn)化關(guān)系。五倍子主要成分為單寧酸和沒食子酸,且兩者之間存在轉(zhuǎn)化關(guān)系。

乳酸菌0111在12h單寧酶活力也達到最高為758.76U/L。單寧酶活力的變化趨勢與乳酸菌活菌數(shù)變化趨勢基本相同。說明,嗜酸乳桿菌0111能夠產(chǎn)生單寧酶,且單寧酶的活力與乳酸菌活菌數(shù)成正相關(guān)。從單獨乳酸菌發(fā)酵液中檢測不到單寧酶的酶活,說明在五倍子單寧存在條件下,可誘導(dǎo)該株乳酸菌產(chǎn)生單寧酶,而乳酸菌產(chǎn)生的酸性環(huán)境加快了單寧酸的水解轉(zhuǎn)化。該菌已申報專利。沒食子酸具有良好的消炎、殺菌、抗病毒等功效。新峰中其他具體成分仍在解析中。

三、中藥乳酸菌發(fā)酵劑在仔豬上的應(yīng)用

按照品種相同、胎次相近、體重相近的原則,選取21-28日齡斷奶仔豬,共75頭,分5個試驗組,每組3個平行,每個平行5頭。分別為空白對照組、乳酸菌組、中藥發(fā)酵組、中藥水提組、腹瀉模型組,并檢測其生長性能、腹瀉率、免疫指標、腸道結(jié)構(gòu)和通透性、腸道菌群等指標。

(一)對攻毒大腸桿菌K88仔豬生長性能的影響

攻毒大腸桿菌后,模型對照組平均日增重、平均日采食量與對照組相比顯著下降,料重比顯著升高,造模成功。各給藥組與模型組相比,顯著提高平均日增重、平均日采食量,顯著降低料重比。發(fā)酵中藥組與空白對照組相比,顯著提高平均日增重、平均日采食量,顯著降低料重比。發(fā)酵中藥組料重比顯著抵于中藥水提組和乳酸菌組差異。中藥發(fā)酵組對仔豬生長性能有較好的促進作用,能顯著提高平均日增重、平均日采食量,降低料重比,效果最優(yōu)。

(二)對攻毒大腸桿菌K88仔豬腹瀉率的影響

中藥發(fā)酵液能在較短時間內(nèi)降低腹瀉率,縮短病程,讓腹瀉仔豬恢復(fù)正常,效果:中藥發(fā)酵組>乳酸菌組>中藥水提組。

(三)對攻毒大腸桿菌K88仔豬體液免疫水平的影響

中藥發(fā)酵液、中藥水提液、乳酸菌菌液在攻毒大腸桿菌后,上調(diào)IgG水平,促進仔豬體液免疫,中藥發(fā)酵組優(yōu)于純中藥和乳酸菌組。

(四)對攻毒大腸桿菌K88仔豬形態(tài)學(xué)分析

模型對照組十二指腸、回腸、空腸絨毛稀松,較短,具有大量脫離上皮細胞碎片。空白對照組因斷奶仔豬腸道發(fā)育不健全,也存在破損現(xiàn)象。中藥發(fā)酵組和乳酸菌組,十二指腸、空腸、回腸絨毛排列緊密,較長,結(jié)構(gòu)完整,無脫落和破損現(xiàn)象。

(五)對攻毒大腸桿菌K88仔豬小腸絨毛高度、隱窩深度的分析

十二指腸、空腸,尤其是回腸的高度和深度均是中藥發(fā)酵組最好,乳酸菌組次之,總體而言,中藥組相對會差一些,這可能與它的定位有關(guān)系。

(六)對攻毒大腸桿菌K88仔豬盲腸微生物OTU分析

1. venn diagram分析

OTU(operationaltaxonomic units),即操作分類單元。即相似性聚類分析,用以表現(xiàn)菌群豐度。試驗共獲得353 個不同OTU,其中五組樣品共有的OTU數(shù)是142個;TCML組中共有 248 個OUT,5個特有OUT;LAC組中共有263 個OTU,18個特有OUT;NC組中共有242個OTU,8個特有OUT;FTCM組中共有264個OUT,25個特有OTU。說明仔豬飼喂中藥發(fā)酵物后,特異性O(shè)UT數(shù)量增加,菌群種類豐富。

2. 等級曲線分析

模型PC組盲腸內(nèi)微生物的OTU等級曲線坡度最大且橫坐標范圍最小。FTCM(中藥發(fā)酵組)等級曲線最平穩(wěn)且橫坐標范圍最大,說明仔豬盲腸中微生物物種分布較均勻,其次是LAC組和TCML組。說明,給藥后,仔豬盲腸中微生物物種增多且分布均勻。

3. 統(tǒng)計分類學(xué)分析

不同組別盲腸內(nèi)容物微生物在門水平下分類(Phylum)優(yōu)勢菌群為后壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)。在屬水平上,盲腸微生物主要有乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、Subdoligranulum、鏈球菌屬(Streptococcus )、Catenisphaera、擬桿菌屬(Bacteroides)、Terrisporobacter和Olsenella等,但各處理組之間的差異較大。與NC和PC相比,三個給藥組(FTCM、TCML和LAC)均增加了乳酸菌Lactobacillus比例,且差異顯著(P<0.05),其中以LAC組含量最高。NC和PC鏈球菌屬(Streptococcus )的含量分別為3.41%和15.49%,與各給藥組差異顯著。

FTCM:發(fā)酵中藥;NC:空白對照組;PC:模型對照組;TCML:中藥水提組;LAC:乳酸菌發(fā)酵液組

(七)對攻毒大腸桿菌K88仔豬盲腸內(nèi)容物細菌16S rRNA α多樣性分析

攻毒試驗組(PC)Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)均降低,Simpson指數(shù)增高。說明攻毒后,仔豬盲腸內(nèi)容物細菌多樣性受到影響。發(fā)酵中藥能顯著改善仔豬盲腸內(nèi)容物細菌多樣性,讓腸道菌群微生物區(qū)系更穩(wěn)固。各處理組的平均覆蓋率均在98.0%以上,說明樣品的測序數(shù)量已完全能夠反映仔豬盲腸內(nèi)容物中的菌群情況。

四、結(jié)語

中藥發(fā)酵將傳統(tǒng)的中藥理論和現(xiàn)代生物工程技術(shù)有機結(jié)合,值得深入研究。中藥發(fā)酵是中藥邁上現(xiàn)代化的必經(jīng)之路,強化中藥資源的有效利用,在動物醫(yī)學(xué)上意義尤其重大。但對于方劑和菌種,應(yīng)該根據(jù)畜禽需要,進行審慎的選擇和科學(xué)評價,切忌想當然和主觀臆斷。而發(fā)酵工藝、關(guān)鍵點控制等應(yīng)規(guī)范化、標準化,保證產(chǎn)品穩(wěn)定性與可靠性。此外,應(yīng)密切關(guān)注發(fā)酵過程中相關(guān)成分的變化,避害趨利。

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